内皮细胞损伤的机制及保护药物的筛选研中究-药理学专业毕业论文.docx

DlSSERTATlON()F DlSSERTATlON()F rh D 壁!!塑!型!型!型型!型塑竺壁垒坠!!g!!!!!竺型型!业壁 一 内皮细胞损伤的机制及保护药物的筛选研究 中文摘要 ／ 蛔酊的研究表明，内皮细胞的损伤与多种血管性疾病有着密切的联系， 改善内皮细胞的功能，保护内皮细胞免受损伤，是预防和治疗血管性疾病的 一个重要手段≯苯实验对内皮细胞的损伤机制、保护药物的筛选及总丹酚酸、 EGb 76I和硫酸多糖916对内皮细胞损伤的保护作用等三个方面进行了研究。 第一部分：内皮细胞损伤的机制研究： ／ (A：用Griess试剂来测定细胞因子和过氧化氢诱导ECV304细胞产生的一 氧化氮，结果表明，IL．1 B和TNFot与ECV304细胞孵育18小时后，降低 NO的产生，但0．1 mM的H202却增加NO的生成。B：通过髓过氧化物酶的 活性来测定中性粒细胞与内皮细胞的粘附；用ELISA法测定内皮细胞粘附分 子的表达；用N．甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)激活中性粒细胞，用硝基 蓝四唑(NBT)还原法测定中性粒细胞的激活率，观察TNF 0【和fMLP对中性 粒细胞．内皮细胞粘附的影响。结果表明，TNFaN量和时削依赖性地增加中性 粒细胞与内皮细胞的粘附作用。FMLP也剂量依赖性地激活中性粒细胞，增加 中性粒细胞对内皮细胞的粘附。同时TNF(x还显著上调内皮细胞粘附分f 1CAM．1、VCAM一1和E—selectin的表达。应用PKC抑制BIM和PTK glJ；h0 剂GS的研究表明，B1M抑制TNFez对1CAM．1和VCAM一1的L-．佩作用，l布 不影响TNFct诱导的粘附分子E．selectin的表达，但PTK抑制剂GS只降低 E．selectin和VCAM．1的表达，而对ICAM．1的表达无明显影响。c：观察了 H202对内皮细胞的损伤作用。用MTT法测定细胞的存活率；用PI染色捌 TUNEL测定H202秀导的内皮细胞的凋亡；用Fura一2／AM测定内皮细胞内游 离钙的浓度；用荧光法测定caspase．3的活性。结果表明，H202显著降低内皮 细胞的存活率，升高细胞内游离ca2十的浓度，增强caspase．3的活性，诱导内 皮细胞发生凋亡作用。D：研究了氧化型胆固醇chol—triol对内皮细胞的损伤作 用。用MTT法测定了细胞的存活率，用PI染色和TUNEL测定了chol-triol 诱导的内皮细胞的凋亡作用及用TBA法观察了氧化型胆固醇诱导内皮细胞产 生的MDA。结果显示，氧化型胆固醇ch01．triol显著降低内皮细胞的存活率， 增加MDA的产生，引起细胞发生凋亡作用。E：观察了脂多糖刺激血管平滑 肌细胞产生的NO对内皮细胞的毒性作用。结果表明，除去LPS刺激的血管 平滑肌细胞仍然持续产生NO，产生的NO对内皮细胞具有薄性作用。NOS抑 制剂L．NNA显著增加细胞的存活率。 以上的研究结果提示，细胞因子和氧 V 博+ 穗== DfSSERT“rIoN DfSSERT“rIoN oF Ph D Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College 应激及内毒素者IIilJ-以引起内皮细胞的损伤，但损伤机理不同。少 ／ 第二部分：内皮细胞损伤保护药物的筛选研究， ／首先，本实验研究用ELlSA方法建立了‘个内皮细胞ICAM-l抑制剂的 高通量筛选模型，并用该模型筛选了近2000个化合物。研究结果表明，LPS 刺量和时间依赖性的增加内皮细胞ICAM．1的表达。在初筛得到的32个化合 物中，用MTT法检测，有毒性作用的化合物有26个，且测定了剩余的6个 化合物对ICAM一1抑制的IC50，其中有5个化合物对TNFot涛导的E-selectin 也有抑制作用。 其次，本研究还用荧光法建立了MMPs抑制剂的筛选模型。结果显示， 同一个化合物对MMP．1，2和9的抑制作用，{：不相同。{ 第三部分：药物对内皮细胞损伤的保护作用， r k在这部分，我们主要观察了总川酚酸、EGb 76l和硫酸多糖916划讷皮细 胞的保护作用。所用方法同第一部分。结果表明，总丹酚酸100 pg／ml一可以湿 著抑制100 ttM H202引起的内皮细胞存活率的降低(P0．001)，还明显降低 Ha02绣导的内皮细胞的凋亡作JfJ，抑制内皮细胞caspase一3的活性(P0 01)， 显著降低H202诱导的内皮细胞游离钙的升高(P0．001)。总月酚酸100 p．g／ml 还可以抑制100 laM ch01．triol对内皮细胞的毒性作用，提高细胞的存活：每 (P0．01)，降低chol—triol引起的内皮细胞的