第六章 酶的分离与纯化(20140320)..pptVIP

亲和层析的四个要素 优点是：条件温和，操作简便，也没有pH值与离子强度等的改变，但可能导致蛋白质回收率降低。 4．沉淀法 用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀，再将沉淀溶解在小体积的样品溶液中。 优点： 浓缩的倍数可以很大 能达到初步纯化的目的 缺点： 往往造成酶蛋白的损失，同时应避免酶的变性失效 5．吸附法： 利用聚丙烯酰胺凝胶等能吸水膨润，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的一种浓缩。 优点： 条件温和，操作简便，也没有pH值与离子强度等的改变 缺点： 只能用于体积较小的酶抽提液 6．透析浓缩法： 将蛋白质溶液放入透析袋中，然后在密闭容器中缓慢减压，水及无机盐流向膜外，蛋白质即被浓缩。 用聚乙二醇（PEG）涂于装有蛋白质的透析袋上，置于4℃下，干粉PEG吸收水分和盐类，大分子溶液即被浓缩。 优点： 条件温和，操作简便，快速有效 缺点： 只能用于小量样品，而且成本很高。 7．反复冻融 原理：抽提液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。 方法一：先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓融解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液； 方法二：先让酶溶液缓缓冻融，然后再移去形成的冰块。 优点：条件温和，操作简便 缺点：需要大功率的制冷设备 。 8．冷冻干燥法 将酶溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后酶呈干粉状。 优点：能使多种酶活性长期保存 缺点：需要冷冻干燥 注意事项：避免抽提液混有有机溶剂 避免抽提液混有磷酸盐 二、酶分离纯化 常用的提纯方法 亲和层析、染料配体亲和层析、免疫吸附层析、 共价层析 亲和部位 离心分离 透析超滤 凝胶过滤 大小或重量 离子交换层析 电泳 等电聚焦 电荷极性 改变离子强度 改变pH温度 改变介电常数 溶解度 方 法 性 质 酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度 （一）根据酶的溶解度进行分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 等电点沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离 盐析沉淀法 分离原理 沉淀分离方法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离 选择性变性沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离 复合沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法 分离原理 沉淀分离方法 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。 1.盐析 由于各种酶在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度不同，故可采用分级沉淀法分离酶。 清蛋白 100% 球蛋白 50% 拟球蛋白 35% 血红蛋白 28%-33% 纤维蛋白原 20% 沉淀析出的蛋白质 硫酸铵饱和度 硫酸铵分级沉淀法 硫酸铵分级改进法（反抽提法） 原理 将包括要分离的酶在内的多种蛋白质一起先沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。这种方法的优点在于许多蛋白质从溶液中沉淀析出十分容易，是非特异性的，但反过来，沉淀在溶液中溶解却有相当高的特异性。 E．coli RNA聚合酶通常在42％—50％硫酸铵饱和度时沉淀。 等电点沉淀法 蛋白质在不同pH下有着不同的溶解度，离等电点越远溶解度度越大，离等电点越近溶解度越小，等电点处溶解度最小。 利用两性电解质在等电点时溶解度低，以及不同的酶蛋白具有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液