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第七章 目的基因的分离技术 第一节 mRNA差异显示技术 （ mRNA differential display reverse transcripion PCR，DDRT—PCR） 第二节 抑制消减杂交技术 (Suppression subtractive Hybridization) 第一节mRNA差异显示技术及其应用 一、mRNA差别显示技术概述 mRNA差异显示技术(mRNA差异显示PCR、差别显示反转录PCR) （ mRNA differential display reverse transcripion PCR，DDRT—PCR） 1992年，美国波斯顿 Dena Farber癌症研究所 P.Liang 、A.D.Pardee（乳腺癌细胞与正常乳腺细胞） 从一对细胞群体或一对基因型各自产生的约15000种mRNA中，有效地鉴定并分离出差别表达的基因。 水稻的抗盐基因、草莓的成熟基因、水稻蔗糖调节基因、拟南芥臭氧诱导基因。 一、mRNA差别显示技术概述 高等真核生物的基因： 看家基因/持家基因（house-keeping gene） 以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动 发育调控基因/奢侈基因 （developmental regulated gene/luxury gene） 以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化 在任一细胞表达的基因约占总数的15%，15000种不同的mRNA 一、mRNA差别显示技术概述 基因的差别表达（differential expression) 生物的发育与分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力的反应、个体的衰老与死亡 哪些基因在何生长发育阶段以及在何种生理状态下表达，决定了整个生命过程。 比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达的差异，是克隆特异表达基因的方法。 二、DDRT技术的原理 （一）锚定PCR 锚定PCR（anchored PCR）是PCR技术的一种改进，一般的PCR实验中需要知道目的基因两端的序列，而锚定PCR技术不需要。 所谓的“锚定”就是指一端已经定死了，另一端通过人工合成引物来定，这就为许多我们对不清楚其5’端区域或是3’端区域的RNA的分析找到了一条良好的途径。 二、DDRT技术的原理 （二）基本原理 3 端锚定引物： 5‘ T12MN 3 ’ （ M为除了T以外的任何一种核苷酸（即 A\G\C)、 N为任何一种核苷酸） 5 T11MN 3 可以将整个mRNA群体在cDNA水平分成大致相等的但序列结构不同的12份亚群体。 PCR扩增 5’- GUCACA???????GGU N M AAA · · · AA - 3’ 二、DDRT技术的原理 （二）基本原理 5 端随机引物 5 端随机引物的长度是10个核苷酸，可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，杂交的部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链3 端的不同位置上。 引物对，50-100条100-500bp之间的DNA条带 12种3 端锚定引物和 20种5 端随机引物240组引物对就能产生出20 000条DNA条带。 （三）DDRT技术路线 ? 处理 对照 三、mRNA差别显示技术的优缺点 1、优点 ①几乎可检测到细胞表达的所有基因 ②可以同时比较多个样品间基因表达的差异 ③具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高经过PCR扩增一些低丰度的 mRNA也可以被检测出来 ④可同时比较多种给定生理状态或不同发育阶段的细胞内mRNA 三、mRNA差别显示技术的优缺点 2、缺点 1）所得特异性cDNA片段假阳性的比例高，75% 原因：总RNA有DNA污染 凝胶中有重叠带 2）特异cDNA片段太短（110bp-450bp)，得不到杂交信号 3）cDNA产物的质量往往较低，在凝胶上 呈现smear状态 4）得到的特异性的cDNA 片段非翻译序列（3 ‘端-UTR，保守，Northern 杂交易出现假阳性），利用 GeneBank进行数据分析不利 5）检测全部 mRNA的工作量很大（T12MN 与20种随机引物组合240次 PCR) 三、mRNA差别显示技术的优缺点 3、技术的改进 1)连接酶介导PCR法（ligation linked PCR ) T12MN与 T7启动子引物 2)cDNA亲合捕获法 32P- dCTP取代dCTP 3）点杂交筛选