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细胞培养基础知识培训材料 中国药科大学新药筛选中心 此材料仅供中心内部使用 最终解释权归新药筛选中心 细胞培养基本介绍 血清 培养基 其他产品 体外培养细胞的分型 ? 贴壁细胞：细胞贴附在支持物表面生长，只有依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞 悬浮细胞：培养时不贴附于底物而成悬浮状态生长，主要来自血，脾或骨髓 体外培养细胞 原代培养：直接从体内取出的细胞进行第一次培养，其优点是组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反应体内的状态；缺点是细胞生长较为缓慢，生长条件要求高 传代培养：将细胞从一个培养瓶按照一定比例转移到另外的培养瓶即为传代培养，其目的是将高密度的细胞进行稀释扩大培养，以避免营养枯竭，影响细胞生长 贴壁细胞培养基本流程 细胞培养主要成分 ①血清 ②基本培养基 ③细胞培养试剂（抗生素、细胞解离，生长因子等） ④平衡盐溶液 血清产品及FAQ 血清的作用 血清提供： 营养和能量来源 生长和粘附因子 肽和类固醇激素 载体蛋白 保护细胞： 免受蛋白酶、毒性物质、pH值波动、机械剪切力、氧化及自由基的损伤。 血清 血清的来源 目前国内可以销售HyClone来自澳大利亚、新西兰、南美的胎牛血清，并且均提供血清来源说明及质量检测报告 血清类型 胎牛血清 特殊处理的胎牛血清 新生牛血清及小牛血清 其他血清：成牛血清、马血清、猪血清等 胎牛血清替代品 检测体系 每批产品都经过严格的细菌、支原体、病毒、内毒素、血红蛋白等检测 如何保存和解冻血清？ a. 血清应该在-20℃保存。如果一次无法用完一瓶，应该无菌分装后冷冻保存。注意：避免反复冻融。 b. 解冻时将血清首先置于冰箱2-8℃中12-24小时使之缓慢部分溶解，然后再放在室温下使之全溶。注意：溶解过程中要每隔一段时间（2小时）缓慢地摇动血清使之混匀。 血清出现沉淀？ 1.纤维蛋白：是常出现的较大的沉淀物。因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（形成絮状纤维蛋白的可溶性前体）在处理过程中仍处于溶解状态，在经过最后的过滤后发生凝结，形成纤维蛋白沉淀。 2.磷酸钙：是一种常见的沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养时会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染 3.其他的脂类和蛋白 4.血清中的沉淀物是难以预测和预防的，但通常沉淀不会影响血清的质量 如何避免血清出现严重沉淀？ 血清有轻微絮状物，但产品比较澄清或略显浑浊是正常现象，但下属操作会致使血清出现严重沉淀，应尽量避免 a.储存不当：反复冻融；长期储存在2-8℃；在室温下放置时间过长 b.不正确地解冻操作，融化时没有混匀。 c.热灭活血清 d.37℃培养血清 e.γ射线辐照 血清常见问题 如想去除这些絮状沉淀物，可将血清分装到无菌离心管中，以400g离心，上清液即可直接加入到培养液内 不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物，因为这可能阻塞滤膜 血清选择？ a. 尽量使用同批次的血清；如果需要更换血清批次，则需事先验证3代以上，因此建议客户单次购买大量血清； b.原代细胞或ES细胞，提供澳洲或新西兰的FBS不同批次进行试用，选择使用效果好的批次； 培养基产品及FAQ 培养基 ? 培养基（Medium）是供微生物、植物和动物细胞生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物 (糖)、氨基酸、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。 ?细胞培养液= 基础培养基+10%FBS+营养添加剂+抗生素 细胞培养液= 减血清培养基+2%FBS+营养添加剂+抗生素 细胞培养液= 无血清培养基+营养添加剂+抗生素 培养基和相关产品 普通液体培养基（Liquid Media，LM） 普通干粉培养基（Dry Powder Media，DPM） 减血清培养基（Reduce Serum Media） 无血清培养基（Serum-Free Media，SFM） 营养成分添加剂（Nutrient Media Supplements） 试剂和辅助产品（Reagents and Cell Culture Support） 普通培养基的应用 BME ( Basal Medium Eagle): 是由Eagle发明的，是最简单的培养基，只有11种氨基酸和盐及一些维生素。最先用于培养小鼠的L 细胞和人类HeLa细胞，现在广泛用于各种细胞的培养 MEM or EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium): 是BME的升级版，氨基酸浓度是BME的