菌上种改良.pptVIP

第四节 生产菌种的改良 菌种选育改良的目标 提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品 菌种改良方法 诱变育种★★★ 细胞工程育种★★ 杂交育种 原生质体融合 基于代谢调节的育种技术★ 基因工程育种★ 蛋白质工程育种 组合生物合成育种 反向生物工程育种 一、诱变育种 人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。 诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。 （一）诱变育种中需考虑的若干因素 选择合适的出发菌株 复合诱变剂的使用 诱变剂剂量的选择 变异菌株的筛选 选择合适的出发菌株 产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。 从自然界分离得到的野生型菌株； 通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株； 已经诱变过的菌株。 诱变剂 诱变剂剂量 既能增加变异幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。 目前处理剂量已从以前采用的死亡率90～99％减低为70～80％。 诱变剂的选择主要根据已经成功的经验，与诱变剂本身特点、菌种的种类和出发菌株的遗传背景等有关。 变异菌株的筛选 一般从菌落形态变异类型着手，发现与产量相关的特征 挑取一定数量的典型菌株复筛，确定各种类型与产量的关系 （二）筛选方法 平皿快速检测法 形态变异的利用 高通量筛选 将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器加样，培养后，用计算机记录结果、分析。 特定的模型筛选 （三）新诱变因子及诱变技术 低能离子束诱变 通常采用N+、H+和Ar+， 相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变 由于能量沉积引起机体损伤，或遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。 激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变 产生光、热、压力、电磁效应，引起DNA或RNA改变 原生质体诱变 （二）细胞工程育种 杂交育种 指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 原生质体育种 （三）基于代谢调节的育种技术 通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的生产或切断支路代谢途径、提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累的方向进行。 组成型突变株的选育 限量诱导物恒化培养 循环培养 抗分解调节突变株的选育 解除碳源调节突变株的选育 流加葡萄糖、应用混合碳源等 抗反馈调节突变株的选育 细胞膜透性突变株的选育 溶菌酶敏感型 例如 谷氨酸发酵中采用生物素（VH）缺陷型菌株 VH是乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸合成 （四）基因工程育种 体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。 它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。 1、基因工程的基本步骤 目的基因的分离 载体的选择与制备 目的基因与载体连接成重组DNA 引入宿主细胞 重组体的选择和鉴定 外源基因的表达 原核表达系统常用：大肠杆菌（E.coli），枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、链霉菌等 真核表达系统常用：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） （五）蛋白质工程育种 定点突变技术 以蛋白质结构和功能的计算机预测为基础，设计新蛋白质的氨基酸序列，应用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶 定点进化技术 * * 出发菌株的选择 菌悬液的制备 前培养 诱变 变异菌株的分离和筛选 物理诱变剂 化学诱变剂 各种射线，如紫外线、X射线、β射线、γ射线、α射线和超声波等 甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、亚硝酸、氮芥等。 各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间 大量稀释 pH值7.0，0.1M磷酸缓冲液或Tris缓冲液 15～60min， 90～120min 0.1～1.0 mol/mL， 孢子3mg/mL 亚硝基胍（NTG） 硫代硫酸钠或大量稀释 pH值7.0，0.1M磷酸缓冲液 10～60min， 孢子3～6h 0.05～0.5M 甲基磺酸乙酯（EMS） 硫代硫酸钠或大量稀释 pH值7.0，0.1M磷酸缓冲液 10～30min， 孢子18～24h 0.5～1％ 硫酸二乙酯（DES） pH8.6，0.07磷酸二氢钠 pH值4.5，1M醋酸缓冲液 5～10min 0.01～0.1M 亚硝酸（HNO2） 大量稀释 加入培养基中，在生长过程中诱变 0.3～0.5％ 氯化锂（LiCl） 大量稀释 数小时或生长过程中诱变 0.1～0.5％ 羟胺（NH2OH?HCl） 大量稀释 加入培养基中，在生长过程中诱变 0