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基因功能分析的基本策略 第一节 转基因技术 一、转基因动物 二、基因转染细胞模型 一、转基因动物 (transgenic animal) (一)概念 应用转基因技术培育出的携带外源基因并能稳定遗传的动物。 (二)基本过程 1、转基因载体的构建； 2、将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞； 3、将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内； 4、对转基因动物进行鉴定。 二、RNA干涉 (RNA interference，RNAi) RNAi广泛存在于自然界 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。 1.RNAi(RNA干扰)的概念 RNAi(RNA干扰) :将与mRNA编码区某段序列相对应的正义RNA 和反义RNA 组成的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默(表达受抑制)。这种转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS) 被称为RNAi. 2.RNAi的机制 现有的RNAi作用机制模型包括两个阶段： 1）起始阶段 2）效应阶段 1）起始阶段 2）效应阶段 siRNA双链结构解旋并结合一个核酶复合物（该核酶复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成。），形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induce silencing complex,RISC）。在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP。活化以后的 被切割后的断裂mRNA 随即降解,从而使该基因的表达受抑,这就是转录后的基因沉默(post -transcription gene silencing ,PTGS) 。 4. 应用 研究基因功能的新工具已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，RNAi成为研究基因功能不可或缺的工具。 肿瘤的基因治疗 抗病毒治疗 复 习 题 1.转基因动物技术在哪些方面已得到广泛的应用？ 2.简述RNA干涉的基本原理。 3.RNA干涉技术的基本过程 1)、确定干涉靶点 选择目标基因是进行RNA干涉的第一步，根据靶基因序列，确定干涉的具体靶点。一般作为干涉的靶点序列应具备： ①、目标RNA上被干涉的靶点应尽量避开蛋白结合位点② 被干涉的靶序列一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征，同时G：C比为50%左右 ③被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有同源性。 2)、双链干涉RNA的合成； 化学合成法；体外转录；表达载体 3)、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上进行监测 第一节 转基因技术用于基因功能分析 第二节 基因打靶技术用于基因功能分析 第三节 反义RNA和RNAi抑制或沉默基 因表达 内容概要 L o g o # 依赖于对模式生物的研究 #有力工具 基因敲除技术、 转基因动物模型、 基因转染细胞模型、 RNA干涉技术 第一节 转基因技术用于基因功能分析 第二节 基因打靶技术用于基因功能分析 第三节 反义RNA和RNAi抑制或沉默基 因表达 内容概要 转基因技术概念 转基因技术是指将外源基因导入受体细胞染色体上，使转基因在受体细胞内表达并发挥其功能的基因操作方法。 利用转基因技术可以制备转基因生物或基因转染细