罗非鱼无乳链球菌的DIG-cfb原位杂交检测方法的建立.PDFVIP

中国农学通报 2015,31(35):66-72 Chinese Agricultural Science Bulletin 罗非鱼无乳链球菌的DIG-cfb原位 杂交检测方法的建立 1 1,2 1 1 3 1,2 1 可小丽 ，曾祖聪 ，刘志刚 ，曹建萌 ，方 伟 ，袁 伟 ，卢迈新 1 （中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州510380 ； 2 3 上海海洋大学水产与生命学院，上海201306 ；广东省水生动物疫病预防控制中心，广州510220) 摘 要：为建立一种批量检测罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) 的快速敏感的原位杂交方法， 本研究依据罗非鱼无乳链球菌cfb 基因序列，选取其132-599 bp 之间的序列为靶序列，采用PCR 法制备 了特异性地高辛标记的DNA 探针DIG-cfb(Digoxigenin-labelled cfb probe ，430 bp) ，同时对所制备的探针 进行了测序鉴定及特异性和敏感性检测。结果表明，探针测序序列与实际GenBank 序列相符，所制备 的DIG-cfb 探针与无乳链球菌基因组杂交呈阳性，与患病罗非鱼的其他细菌病原（嗜水气单胞菌、金黄 色葡萄球菌、类志贺邻单胞菌以及海豚链球菌）基因组，以及与无乳链球菌亲缘关系较近的链球菌其他 种（牛源链球菌、变异链球菌），斑点反应则均为阴性，dNTP 对照组也为阴性，表明该方法特异性强；该 方法可实现对批量样品的快速检测，具有较高的灵敏度，可检测无乳链球菌基因组的下限为1.5 ng/μL DNA 。对采集于广东、海南及广西等不同地点的无乳链球菌样品，均可获得较明显的斑点反应圈，对患 链球菌病的罗非鱼肝、脑组织基因组也可特异的检测出无乳链球菌。表明本研究建立的DIG-cfb 原位 杂交法对无乳链球菌基因组的检测具有快速、特异、敏感等特点，适合罗非鱼无乳链球菌的批量检测。 关键词：无乳链球菌；cfb 基因；PCR ；地高辛标记探针；原位杂交 中图分类号：S854.4+4 文献标志码：A 论文编号：cas ConstructionofDigoxigenin-labeledcfbinSituHybridization MethodofStreptococcusagalactiaefromTilapia 1 1,2 1 1 3 1,2 1 KeXiaoli,ZengZucong ,LiuZhigang,CaoJianmeng,FangWei,YuanWei ,LuMaixin (PearlRiverFisheriesResearchInstituteofCAFS/KeyLaboratoryofTropicalSubtropicalFisheryResourceApplicationand1 Cultivation,MinistryofAgriculture,Guangzhou510380; 2CollegeofFisheriesandLife,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306; 3GuangdongProvincialAquaticAnimalEpidemicDiseasePreventionandControlC