霍奇金淋巴瘤实上验设计.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 霍奇金淋巴瘤中IκBα基因突变的研究 研究背景 霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL，Hodgkin’s disease，）是恶性淋巴瘤的一个独特类型。 研究背景 其特点为：①临床上病变往往从一个或一组淋巴结开始，逐渐由邻近的淋巴结向远处扩散。原发于结外淋巴组织的少见。 研究背景 ②瘤组织成分多样，但HL特异性的病理改变为——大量反应性增生的背景淋巴细胞中可见少于1%Reed-Sternberg细胞（R-S细胞）。 这种特殊的瘤巨细胞来源于B淋巴细胞 (镜影细胞) 研究背景 p53和bcl-2基因突变 EB病毒感染 但证据均不足，HL的发病机制 尚未明确 肿瘤细胞 研究背景 有研究发现NF-κB (RelA/P50)的组成性激活是霍奇金淋巴瘤细胞的特点。[1] IκBα作为重要的NF-κB通路抑制因子，在多种瘤细胞中表达量均减少。 研究背景 将对IκBα激酶 （IκBα kinase, IKK）无反应的IκBα突变体导入HRS细胞中可阻断NF-κB的活化，导致细胞凋亡，说明IκBα在HL发病机制中有重要作用。[2] 研究背景 Emmerich等人的研究表明HRS细胞中IκBα mRNA高表达，但在蛋白水平检测的阳性强度弱，可能与HL中泛素化降解活性增强有关，也可能由IκBα蛋白结构改变导致。[3] 研究目的 本实验意在： ①了解IκBα基因在HL中突变的情况； ②分析经典型HL HRS中IκBα突变的特点、可能造成的蛋白结构异常； ③以及这些异常的病理意义，即其与HL发病的相关性。 实验材料与试剂 霍奇金淋巴瘤组织样本 CD30单抗（Dako公司，克隆号Ber—H2，效价1：20） Leica ASLMD激光显微系统 PCR引物（北京赛百胜公司） PCR仪（包括反应体系） DNA测序仪 实验流程 CD30免疫组化 激光显微切割和DNA 提取 IκBα基因扩增 PCR产物检测 待测基因外含子测序 CD30免疫组化 采用EnVision两步法。 将冰冻组织切成6μm厚连续切片，贴于Leica PEN膜空白切片上，用含0．05％ NP40的丙酮(v／v)固定10 min，室温下自然干燥； CD30免疫组化 6％ H2O2-甲醇，37℃ 10 min，消除内源性过氧化物酶； 加1：20稀释的一抗； 加相应的二抗，DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，充分水洗。 激光显微切割和DNA 提取 用Leica ASLMD系统逐个切割组织切片上的CD30阳性细胞（切割参数：激光强度37，波长377，速度5，光束直径8）。 将目的细胞从切片上分离，在光压强作用下被收集到离心管盖内，每例标本3～6组，每组约25～70个细胞。 切割周围的正常淋巴细胞每例2管， 每管约50个细胞。 扩增目的基因，上游引物： 5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游引物：5’一GGTc1-ITI’GCGGATGTCCAC一3’。 （缓冲体系：10X反应缓冲液2．5 μ l，MgCL2(25 mmol／L)1．5 μ l，dNTP(10 mmoL／L)1．0 μ l，上游引物(10~ μ moL／ L)0．5 μ l，下游引物(10 μ mol／L)0．5 μ l，Taq酶(5 U／ μL)0．3 μ l， 模板2．0 μ l，总体积25 μ l。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55％退火1 min，72oC延伸1 min，共40个循环，72℃延伸7min，至4℃结束。 以双蒸水代替DNA模板作为阴性对照。） IκBα基因扩增 对HRS细胞、背景中反应性增生细胞的IκBα 6个外显子进行半巢式PCR扩增。 用已知IκBα外显子PCR扩增阳性的标本为模板作阳性对照，用双蒸水作为阴性对照。 PCR扩增反应体系 扩增IκBα第一和第二外显子反应体系： 10 X PCR缓冲液5．0 μ 1，MgC1：(25mmoi／L)5．0 μ Ixl，dNTPs(10 mmol／ μ L)2．0 μ l，DMSO2．0 μ l，Taq DNA聚合酶(5 U／pJ)1．0 μ l，DNA模板(0．5 g／IL1)2．0 μ l，扩增第一外显子时加引物1 μ Ixl；扩增第二外显子时加引物0．3 μ l，补所需ddH2O使反应体系达到50 μ I。反应条件：预变性95℃ ，5min，继而95℃变性50 s，65℃退火3