c00微生物学实说验基本操作与培训.pptVIP

微生物基本实验操作技能要领及注意事项 一、无菌操作 1、无菌概念： 什么地方是有菌的，什么地方是无菌的； 哪些地方要求基本无菌，哪些地方严格要求无菌。 2、操作环境： 实验室；接种箱；超净工作台；无菌工作室。 3、工作范围： 接种、转管、倒平板、梯度稀释、涂平板、平板划线、菌体(菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。 一、无菌操作 4、要领及注意事项： （以实验室接种、转管为例） 　（1）斜面、接种环拿法； 　（2）火焰保护； 　（3）接种环灭菌； 　（4）接种环冷却及轻快接触斜面； 　（5）棉塞的制作及处理。 二、染色、制片 1、类型：分装片和涂片； 2、操作步骤：（以涂片为例） 1） 涂片：载玻片---滴加生理盐水---挑菌涂成 薄膜； 2）干燥：室温自然干燥： 3）固定：菌面向上，火焰上过2-3次： 4）染色：滴加染色液（美蓝）,覆盖（2-3分 钟）； 5）水洗：自来水冲洗，至基本无色，晾干； 6）镜检：调节光源，低倍镜观察，高倍镜观察， 油镜观察。 二、染色、制片 4、要领及注意事项： （1）生理盐水和菌体一定不能过多； （2）菌膜不能过厚，最好细胞分布疏密相间； （3）固定要到位，不能残留水，也不能固定过度； （4）染色时间正确，一定要按规定计时； （5）水洗时，水流不宜过急； （6）镜检前片子一定要干燥无水。 三、油镜头的使用 1．工作范围： 观察细菌及相近大小的微生物，真核微生物的细胞器。 2、使用特点： 一定要用油；操作要求较高。 三、油镜头的使用 3、要领及注意事项： （1）所用装片、涂片上一定不能有水； （2）先用低、高倍镜观察并选好视野，并将待 观察目标调至视野正中心； （3）注意保护镜头和片子，从侧面观察镜头进 入油系； （4）油镜头观察时，用微调调焦距，始终按 镜、片分离方向用微调调焦距； （5）调焦距速度一定要慢，避免焦躁,因为图象 出现的焦距范围很小； （6）注意光线的强弱； （7）用擦镜纸蘸取溶剂（二甲苯）擦净镜头和装 片。 四、革兰氏染色 1．工作范围： 细菌学中最重要的鉴别染色法之一，也可用于 其他微生物的鉴别中。 一般的微生物形态观察不必用革兰氏染色。 2、基本步骤： 1）初染：结晶紫染色； 2）媒染：碘液媒染； 3）脱色：乙醇脱色； 4）复染：番红复染; 四、革兰氏染色 3、要领及注意事项： 1）菌种的菌龄，要选择生长旺盛期的典型菌体； 2）制片，按单染色的基本要求操作； 3）乙醇脱色时间是本实验成功与否的关键，注意 衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为 止，约20—30秒，立即用水冲净乙醇； 4）观察时，以分散开的细菌颜色为准。 5）对未知菌进行革兰氏染色时，应选择两株形态 不同、染色结果不同的已知菌和未知菌一起混合 制片、染色。 五．细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌体形态的差别 （1）细菌、放线菌是原核生物，酵母菌和霉 菌是真核生物，大小不同； （2）放线菌和霉菌是丝状菌，细菌和酵母菌 是非丝状菌； （3）霉菌有孢子柄、子实体等特化形态，放 线菌没有。 （4）一定要注意提问，不要理解为菌落形 态。 六、用血球计数板计数微生物的数量 1．工作范围： 此法计得的是死、活菌的总数，故称总菌计数法。 2、基本步骤： 1）稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液不浓，可不必 稀释。 2）镜检计数室：在计数前，先对计数板的计数室进行镜 检。若有污物，则进行清洗。 3）加样品：盖上盖玻片，用毛细管将菌液由盖玻片边缘滴 一小滴，让其自行渗进计数室。不可有气泡。 4）显微镜计数：五分钟后，先低倍镜找计数室，后高倍镜 计数。一般以每小格5—10个菌体为宜。常选四角