酵母菌筛选的方案.doc

第一部分：酵母筛选收集 一．土样中酵母的分离： 1．土壤的采集处理 采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。 将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。 2. 土壤中菌种的分离： 称取1 g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 ℃，12 h，180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。 为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 二．葡萄果表酵母的分离: 1. 葡萄的采集： 葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。 2. 菌种分离步骤： 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。 随机选取并称量约 10g成熟葡萄，放入盛有 90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养 30min后静置，制成菌悬液，吸取 50μl 放入 YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养 24～48h。观察菌落的大小及生长状况。 然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基 表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。 为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 三. 自然发酵过程中酵母菌的分离: 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。 称量约 100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的 500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔 24h 取发酵液1ml，加入 9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。 取 0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置， 28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。 为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。 四. 设备表面酵母的分离： 取擦拭过设备表面的棉球，将其中的菌液挤出，取1 m菌液经梯度稀释法结合划线分离得到单菌落。以上菌液通过梯度稀释法进行划线分离单菌落：无菌条件下取1 ml含菌的样品处理液→用无菌的生理盐水稀释为若干梯度（10-1-10-7）→将稀释液涂布于固体培养基平板，28 ℃培养3d→菌落计数→观察，编号并记录。 观察和记录完毕后，挑选不同菌落中的每一菌株制成水浸片（染色），并编号。将各个水制片在高倍镜下观察各株菌的个体形态，并记录。 选出具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，用灭菌后的接种环挑去不同菌落，在分离培养基上连续划线分离2~3次，进行纯化。 菌种的保藏： 分离纯化得到的酵母单菌落接种于培养基进行液体培养，培养的条件为：温度是 28 ℃，转速为180 r/min，时间为 18～24 h。当菌体培养好后，将菌液和灭菌后的甘油按体积比为 7: 3 的比例进行混合，混合摇匀后于-20 ℃下保藏待用。 PS：以上分别进行培养基筛选试验，可