华癸根瘤菌7653r中rnd型外排泵家族基因的共生功能研究-微生物学专业论文.docxVIP

华癸根瘤菌7653R中RND型外排泵家族基因的共生功能研究2．2．7固氮酶活的测定 华癸根瘤菌7653R中RND型外排泵家族基因的共生功能研究 2．2．7固氮酶活的测定 ．．22 2．2．8蛋白的诱导表达 ．．22 2．2．9 Western blot．． ． ．． ． ． ． ．． ． ． ． ． ． ．． ．． ． ． ． ．． 23 3结果和分析 ．24 3．1华癸根瘤菌7653R中RND家族基因转录组分析 24 3．2 MCHK 0866、MCHK 0867组成的药物外排泵的功能和调控 ．26 3．2．1目的基因的结构分析 26 3．2．2缺失MCHK 0866、MCHK 0867对根瘤菌自生生长的影响 ．29 3．2．3抑菌物质的敏感性 30 3．2．4敏感性药物对基因表达的影响 3 1 312．5 MCHK 0866、MCHK．0867转录调控的初步检测 ．．32 3．2．6 EMSA验证转录调控的前期工作 34 3．3其它RND基因插入失活突变体的构建以及共生表型鉴定 36 3．3．1插入失活突变载体的构建 36 3．3．2插入失活突变体的筛选 37 3．3．3突变菌株共生表型 ．．39 4讨论 44 4．1 RND家族基因研究在根瘤菌中的新颖性及研究价值 ．44 4．2对华癸中慢生根瘤7653R中RND外排泵分析 ．．45 4．3 RND外排泵功能的鉴定 ．45 4．4 RND外排泵表达调控的初步探索 ．46 4．5 RND家族在共生根瘤中表达未发生显著变化基因的共生功能思考 ．46 4．6进一步研究设想 ．47 5参考文献 48 致{射 ．57 文章发表情况 58 附表 ．59 万方数据 华癸根瘤菌7653R中RND型外排泵家族基因的共生功能研究摘要 华癸根瘤菌7653R中RND型外排泵家族基因的共生功能研究 摘要 虽然细菌外排泵的研究历史较长，其涉及的药物运输功能研究主要集中在病原 菌中，根瘤菌中外排泵的研究较少，外排泵系统相关基因在根瘤菌共生固氮中的功 能表型和作用机制也值得深入研究。本文研究了华癸中慢生根瘤菌7653R中RND 家族基因的功能。获得了如下实验结果： 一方面，我们基于前期工作中的根瘤菌7653R转录组数据，分析发现 MCHK一0866、MCHK一0867两个基因在共生条件下明显上调表达，这两个基因表达 产物组成一个RND型外排泵。对外排泵编码基因及候选调控基因在基因组上的组织 结构进行了分析。采用测定OD600观察菌株生长曲线的变化。通过测定最低抑菌浓 度检测菌株的药物敏感性，RT-PCR检测目的基因经特定物质处理后表达量的变化。 通过细菌单杂交系统初步检测外排泵的转录调控。结果显示，MCHK 0866和 MCHK一0867所编码蛋白共同组成一个RND家族射流泵。缺失该外排泵后，细菌生 长曲线在稳定期OD600数值降低，对萘啶酸、四环素和SDS的敏感性发生变化，萘 啶酸处理细菌后两个基因的表达量增加。下游属于Te依转录因子家族的基因 MCHK 0869表达产物作用于MCHK 0867的启动子区域。该外排泵与萘啶酸的运 输有关，缺失后自生生长受到影响，表达受到下游转录因子的调控。MCHK 0867 插入失活后对结瘤能力和固氮酶活影响较大，与双突变菌株共生表型相似。 另一方面，本文选取另外3个在共生根瘤中表达水平无显著变化的RND家族基 因，分别构建了其基因插入失活突变株。对突变菌株进行了共生表型实验。结果发 现MCHK 081 1和MCHK 3948基因失活后，对结瘤能力和根瘤固氮酶活有一定的 影响；MCHK 6517失活后对共生表型没有影响。 上述结果为后续研究根瘤菌外排泵中与共生固氮相关基因的作用机制，提供了 研究材料和工作基础。 关键字：华癸根瘤菌7653R，RND，外排泵，萘啶酸，共生表型 万方数据 华中农业大学2016届硕士学位论文Abstract 华中农业大学2016届硕士学位论文 Abstract Although the bacteria effiux pumps had been studied a long history,but function about translate drugs mainly focus on patheogens．There are very less research about effiux pumps in rhizobium，effiux pump system genes in the functional phenotype and mechanism in symbiosis is worth in-depth study．This work investigate the RND effiux family