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K 原核生物的转录 K1 转录的基本原则 K2 大肠杆菌RNA聚合酶 K3 大肠杆菌s70启动子 K4 转录的起始、延伸与终止 K1 转录的基本原理： 转录概述： 起始 RNA 聚合酶结合到双链DNA上； 聚合酶在DNA 上滑动找到启动子； DNA 螺旋的解开 从起始位点开始合成, 该位点标为＋1。 延伸： 在RNA的3`加入dNTP; RNA聚合酶沿着5’? 3’ 延伸新合成的RNA链， RNA聚合酶自身则沿着反义DNA链从3’ ? 5’ 前进。 E. coli 聚合酶: a 亚基 核心酶有两个相同的a亚基； a 亚基由 rpoA 基因编码； a 亚基对于全酶组装必须； a 亚基尚没有发现明确的转录功能， 但是对于启动子的识别很重要。 β亚基由 rpoB 基因编码, 为核心酶的成分； β亚基被认为是RNA聚合酶的催化中心： b亚基可能包含两个结构域，一个负责转录起始，一个负责转录延伸。 s 因子 通过将核心酶对非特意性序列的亲和力的降低(104倍)，同时增加其对启动子的亲和力来帮助启动子的识别. 2. s 因子的结合将核心酶转变为全酶， s 因子在起始后当RNA链延伸到 8-9 nt时， s 因子会从全酶上释放下来。 3. 细胞内s 因子的数量只有核心酶的30％。 细菌噬菌体T3 和 T7 RNA聚合酶就是单链的多肽 启动子效率 : 是RNA聚合酶结合并起始转录的一段保守的DNA序列 1.转录起始位点为＋1 (position +1), 因而转录启动子的位置数为副值； 2.包含有对RNA聚合酶结合和起始转录的一段短的序列； 3.突变分析表明，只有很短的几个保守序列是启动子行使功能所必须的。 启动子大小： 1.σ70 启动子由 40~60 bp的序列组成, -55 to +20 被聚合酶结合; 2.-20~+20 区域在DNaseI消化时被强烈保护； 3.突变分析表明，直至 – 40 的区域对启动子的功能是必须的； 4. 在-10 到 -35 区域间的的两个 6 bp 序列在E.coli启动子中尤为重要。 -10 序列 1.6 bp 的保守序列大概在 –10 位置 (Pribnow, 1975)； 2. 共有的一致序列是： TATAAT； 3. 起始的两个碱基(TA) 和最后的碱基 T 在E.coli启动子中最保守； 4. 这个六碱基序列到转录起始点的碱基数为5 到 8 bp ，尽管其间隔序列不重要但是碱基数（距离）重要； 5. －10序列是聚合酶启动DNA解旋的序列；  -35 序列提高RNA聚合酶识别和与s 因子的相互作用的能力 1.–35 位置附近的一段保守的六具体序列； 2. 一致序列为： TTGACA； 3.起始三个碱基 (TTG) 在 E. coli 启动子中最保守； 4. 在90%的E. coli 启动子中，与 –10 序列间的距离为 16-18nt。 转录起始点 启动子效率 (1) 主要影响因素: 不同启动子间的序列差异很大，转录的效率相差可以达到1000倍; -35序列组成增强与聚合酶σ因子相互识别和相互作用的识别区； -10 序列对于DNA的解旋很重要； 起始位点附近的序列可以影响转录的起始. 启动子效率 (2)：同时注意: 最初转录的30个碱基序列也影响转录： 该序列控制RNA聚合酶离开启动子，可以使另外一个聚合酶复合物重新起始转录，由此影响转录的速率甚至整个启动子的强度. DNA的负超螺旋可以增强转录的起始； 某些启动子的启动强度不够，需要辅助因子的激活： 如 Lac 启动子 Plac 需要 cAMP 受体蛋白 (CRP )的 结合以增强转录的起始。 K4 转录的起始、延伸和终止 与启动子 的结合 Promoter binding ? 核心酶 (?2? ?’?) 对 DNA具有非特异性的结合能力 (松散结合但是稳定, ? 因子的加入，核心酶对非特异DNA的亲和力降低20000 倍 ). ? ? 因子使全酶结合到特异性启动子的能力增强100倍 ? RNA聚合酶通过滑动找到启动子序列，识别双链的–35 和 –10 序列，聚合酶和配对状态的启动子DNA形成闭合的复合物。 DNA 解旋： ? 为使反义链实现碱基配对，DNA双螺旋必须被聚合酶解旋； ?负超螺旋能够增强许多基因的转录 ，但是也有例外的，如：促旋酶则被负超螺旋抑制 ； ? DNA 的初始解螺旋导致DNA与聚合酶形成开放的复合物，这一过程称为紧密结合； RNA 链的延伸： ? 不需要引物 ； ? 链以 GTP (more common) 或 ATP开始； ? 聚合酶最先掺入最初两个核苷酸； ? 最