基于alphalisa技术检测胰岛素样生长因子1受体与其相关通路蛋白相互作用方法的建立-免疫学专业论文.docxVIP

硕士学位论文Pathway，NF—kappa 硕士学位论文 Pathway，NF—kappa B Pathway，mTOR Pathway等。在肿瘤中，IGFlR也起 到重要作用，可能参与到肿瘤的生长、侵袭、抗凋亡和转移等。IGFlR蛋白可 以与多种蛋白如Csk、SOCSl、GRBl0、FAK等有直接相互作用参与信号通路。 有关报道，IGFlR与Csk、SOCSl存在相互作用。C—Src蛋白酪氨酸激酶 (C—Src tyrosine kinase，Csk)是Src激酶家族(SFKs)的成员，为SFKs的负 调节蛋白。Csk是非受体酪氨酸激酶，需要跨膜受体如IGFl受体，EGF受体， T细胞受体或跨膜衔接蛋白如CBP等的帮助完成信号传递。推测Csk发挥功能 与其同这些蛋白的相互作用有关。SOCSl是细胞因子信号(SOCS)蛋白家族 抑制器的一个成员，SOCSl成为肿瘤的研究热点。在某些肿瘤，SOCSl表达， SOCSl基因甲基化，突变和缺失下降。SOCSl已经在许多癌症中，例如结肠直 肠癌，乳腺癌，肝癌发挥了重要的作用。 IGFlR与多种不同蛋白的相互作用使其发挥不同的功能，因此研究不同生 理病理过程中IGFR的蛋白相互作用非常重要。我们希望通过一种新的方法来 研究蛋白质与蛋白质的相互作用。 方法： 采用双抗体夹心法研制IGFlR与蛋白Csk、SOCSl等的光激化学发光免疫 分析法。 1．制备IGFlR抗体的原料制备： 提取Hela细胞的RNA，使用逆转录试剂盒得到cDNA。使用Primer 5软件、 pMal．c2x载体图谱及GenBank中IGFlR基因序列(NM 001291858)设计IGFlR 蛋白的B段引物，在下游引物上加入6个his标签，并在引物两端加入BamH I、 EcoR I酶切位点及保护碱基。通过PCR得到目的基因。将pMal．c2x载体同获 得的PCR产物同时进行BamH I、EcoR I双酶切，酶切产物连接后转入到TOPl0 感受态中。使用酶切和测序鉴定重组质粒是否成功。 将鉴定重组成功的质粒转入到BL21感受态中，通过改变诱导的温度及诱 导剂IPTG浓度获得最佳表达条件。按照最佳表达条件进行大量表达。收集诱 导后的细菌重悬、反复冻融、超声破碎、高速低温离心等，得到表达上清，通 III 万方数据 中文摘要过SDS—PAGE考马斯亮蓝染色进行表达鉴定。将上清分别经过AmyloseResin 中文摘要 过SDS—PAGE考马斯亮蓝染色进行表达鉴定。将上清分别经过AmyloseResin 和镍柱进行亲和层析纯化，通过SDS．PAGE考马斯亮蓝染色进行纯化结果鉴定， 比较两种纯化方法的优劣。并最终得到纯化的蛋白，送广州瑞博奥进行抗体制 备。 2、IGFlR、Csk、SOCSl等蛋白的真核表达，及相互作用的鉴定 提取Hela细胞的RNA，使用逆转录试剂盒得到cDNA。使用Primer 5软件、 pCNDA、pENTER载体图谱及GenBank中基因序列分别设计IGFlR蛋白的B 段，IGFlR全长，IGFlR—Q，Csk，SOCSl，FAK，IGFl，IGFBP3，GRBl0， SHCl的引物，并在引物两端加入相应的酶切位点及保护碱基。通过PCR得到 目的基因。割胶回收后，将pCDNA、pENTER载体同获得的PCR产物同时进 行双酶切，割胶回收酶切产物，酶切后的目的片段与载体按照7：1质量比通过 T4DNA连接酶进行连接后，转入到TOPl0感受态中，将细菌涂板。12h后挑 去单克隆的菌落，摇菌提取重组质粒。使用酶切和测序鉴定重组质粒是否成功。 将鉴定重组成功的重组载体通过脂质载体转染的方法转染到293T中进行 真核表达，通过Westemblot及免疫荧光定位鉴定蛋白是否表达。 参考文献及获得抗体的难易程度，我们首先选择检测IGFlR与SOCSl， IGFlR与Csk的相互作用。 将重组表达成功的IGFlR．B．pENTER分别与Csk-pENTER， SOCSl一pENTER共转染与293T细胞中，通过Westemblot鉴定共表达效果。并 通过改变IGFlR．B．pENTER与Csk．pENTER,SOCSl．pENTER共转染的质粒比 例达到表达的IGFlR与Csk蛋白，IGFlR和SOCSl蛋白表达量达到1：l。 使用COIP及荧光共定位的方法鉴定IGFlR与Csk、SOCSI的相互作用。 3、初步建立IGFlR与Csk、SOCSl相互作用检测反应体系及反应条件摸索 使用已经在化学发光检测体系建立了比较完整的AFP抗原和配对的AFP 抗体，建立光激化学发光免疫分析检测体系。使用硼氰基化钠化学连接法将发 光微球与AFP抗体1连接，AFP抗体2进行生物素化。通过改变发光微球与 AFP抗体1连接的比例，