第2章化蛋白质.ppt

不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%饱和度 饱和 析出 析出 分 段 盐 析 盐 溶 而低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。 盐溶作用是由于在盐浓度较低时，盐离子被蛋白质分子吸附，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强了，因而溶解度增加。 2、有机溶剂沉淀 与水互溶的极性有机溶剂（乙醇、丙酮）能使蛋白质从水溶液中沉淀出来。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的原因是： ①降低溶液的介电常数（因为有机溶剂是低介电常数物质）。介电常数降低将增加两个相反电荷之间的吸引力（库仑定律），这样蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，从而使蛋白质分子聚集沉淀。 ②有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子聚集沉淀。 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。 3、重金属盐类沉淀 蛋白质在碱性溶液中（pHpI)解离成阴离子而带负电荷，可与带正电荷的重金属离子如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等结合成不溶性蛋白盐而沉淀。 4、生物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣酸、苦味酸、钨酸和碘化钾。某些酸类是指三氯乙酸、磺酰水杨酸和硝酸。 当溶液pHpI时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。 5、加热变性沉淀 加热变性是通过加热使蛋白质天然构象解体而变性，蛋白质变性后疏水基外露，水化层被破坏，从而发生沉淀。 当蛋白质处于等电点时，沉淀最完全、最迅速。 五、蛋白质的变性与复性 1、变性（Denaturalization)的概念 天然蛋白质分子因受物理或化学因素的影响，分子中的次级键被破坏，天然构象解体，致使蛋白质理化性质及生物学功能随之发生变化，这种现象称为变性。 变性 变性的实质是次级键被破坏，天然构象解体。变性不涉及共价键（肽键、二硫键）的破裂，一级结构保持完好。 变性后的蛋白质称为变性蛋白。 变性 2、 导致蛋白质变性的因素 导致蛋白质变性的因素很多： *物理因素如加热、高压、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈震荡、搅拌等。 *化学因素如强酸、强碱、脲、盐酸胍、去污剂、有机溶剂等。 去污剂：破坏疏水作用 脲、盐酸胍：破坏氢键和疏水作用 ??有机溶剂：能破坏氢键，削弱作用 3、蛋白质变性后的特征 ①生物活性丧失。蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体等活性，以及其他特殊性质如血红蛋白的载氧能力等。生物活性的丧失是蛋白质变性的主要特征。 ②一些侧链基团暴露。蛋白质变性时，有些原来在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧链基团，由于结构的伸展松散而暴露出来，从而易与化学试剂反应。 ③一些物理化学性质改变。 蛋白质变性后，疏水基外露，溶解性降低，一般在等电点区域凝聚沉淀； 球状蛋白变性后，分子形状也发生改变，分子伸展，不对称性增加，表现为粘度增加，扩散系数降低； ④生物化学性质改变。蛋白质变性后，分子结构伸展松散，比天然蛋白质易为蛋白水解酶分解。 制备活性蛋白质时严防蛋白质变性 4、复性 如引起蛋白质变性的因素比较温和，当变性因素除去后，变性蛋白又可重新回复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。 核糖核酸酶变性与复性作用 Native ribonuclease Denative reduced ribonuclease Native ribonuclease 8 M urea and ?-mercapotoethanol Dialysis 变性 复性 透析除去尿素 和巯基乙醇 8mol/L尿素 β-巯基乙醇 但是否所有的蛋白质变性都是可逆的，目前仍有疑问。 六、蛋白质的呈色反应 蛋白质分子中末端α-NH2、α-COOH、肽键及某些AA残基的侧链基团如：Tyr的酚基、Arg的胍基等能与某些化学试剂作用，产生颜色反应。如： 双缩脲反应 酚试剂反应：蛋白质分子中的Tyr的酚基能将福林试剂（磷钼酸和磷钨酸）还原成蓝色化合物。 650nm比色定量测定。 坂口反应：精氨酸的胍基能与次氯酸钠（或次溴酸钠）及α萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。 可用来鉴定含精氨酸的蛋白质，也可定量测定精氨 酸含量。 双缩脲反应 蛋白质中两个以上相邻的肽键在碱性溶液中也能与CuSO4反应，产生红紫色络合物， 540nm波长比色，定量测定蛋白含量