蓝白斑筛选原理及问题总结.docVIP

HYPERLINK /bbs/forumdisplay.php?fid=8filter=typetypeid=4 [资源共享] 蓝白斑筛选原理及问题总结 1 问题：做转化时，用蓝白斑筛选，以获得阳性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用蓝白斑筛选，有什么区别吗？蓝白斑筛选有什么作用吗？对于这一问题，我想，抗性筛选是防止杂菌生长。理论上说，当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖。蓝白筛选是验证是否有插入片断。两者结合起来，更有利于筛选到我们的目的菌。2 问题：如果加了AMP、IPTG和X-Gal，长出来的白斑一定都是含有插入片段的吗？有没有可能是载体自连的？答：可以说，世界上没有绝对的事情，即使加了AMP、IPTG和X-Gal，长出来的白斑也不一定都是含有插入片段的阳性克隆，具体原因可能有：1）有可能是载体自连的假阳性；2）作时AMP、IPTG和X-Gal其中一种或几种没涂均匀。3）有时即使插入片段也会出现篮斑。只要编码框没被破坏。3 问题：如何筛选重组菌落? 答：可使用蓝/白斑筛选法，在涂布有IPTG和X-Gal的筛选平板上，重组菌株为白色，未转入重组质粒的菌株为蓝色。 4 问题：蓝白斑筛选如何筛选合适的宿主菌株?答：如进行蓝/白斑筛选，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。 5 问题：在蓝白斑筛选的过程中没有蓝斑是什么原因导致的？因为通过PCR检测插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并没有插入片段。答：原因很多，1）可能是你用的培养基含有乳糖或葡萄糖，因为半乳糖甘酶会分解乳糖，导致不能与X-Gal反应，葡萄糖不会诱导融合基因的表达。2）作时AMP、IPTG和X-Gal其中一种或几种没涂均匀。3）很多因素会造成PCR失败。6 问题：我最近转化大肠杆菌时，通过蓝白斑筛选，挑出白色菌落做PCR，可是在电泳时发现在有目的带的同时还有比目的带小的杂带，不知为什么？我反复筛了几次，都是这样，可不可以摇菌提质粒？我应该下一步怎么做？答：针对这样的情况，我觉得，你首先做酶切鉴定，看看你的目的片段是否真正插入。其次，你应该检测PCR过程有没有问题。7 问题：我用Amp-IPTG-X-gal LB平板进行蓝白斑筛选重组子，为何筛出的全是白斑，没一个蓝斑，挑几个白斑摇菌扩增后PCR检测也全是阳性克隆，不会全都重组成功了吧？什么原因呢？答：这样的情况是完全有可能的，只要载体处理的好，应该说是有这种可能。蓝白斑筛选原理：蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。IPTG 与X-Gal介绍IPTG即Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，也称Isopropyl β-D-thiogalactoside，中文名为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。分子式为C9H18O5S ，分子量为238.30，CAS Number 367-93-1，Ultra Pure，dioxane free，常用于蓝白斑筛选，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。IPTG 与X-Gal配置X-Gal：中文名为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物,在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。IP