《PCR》-课件设计（公开）.pptVIP

实时荧光定量PCR （fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR） 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。 实时定量PCR技术(fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR) ，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。 实时荧光定量PCR 是一种新型诊断工具，具有敏感、难、快速、准确的特点，是目前确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法，并且在核酸快速扩增的同时实现模板的定量测定。 常规PCR方法的局限性分析： 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒 无法对扩增反应实时检测 定量的最佳时期 Quantitative information comes from monitoring the early stages of amplification. 荧光定量PCR和常规PCR技术的区别 常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析（定量不准确）； 荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法（准确定量） 。 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR检测时,在普通PCR的基础上加入的荧光化合物可分为非特异性的嵌入荧光染料及特异性荧光(引物)探针两大类型。前者是利用嵌入荧光染料检测,只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,是一种非特异性的检测方法。后者由于增加了探针的识别步骤,特异性、专一性更高。二者各有优缺点,在不同的研究目的中被应用。 它们的基本原理是:扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。 非特异性的嵌入荧光染料 SYBR Green I 核酸染料 SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单，无须脱色或冲 洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等。 非特异性的嵌入荧光染料评价 优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况。 特异性的荧光探针 特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合,在PCR过程中可对产物实现均相、实时、定量检测,也适用于多通道检测。 TaqMan探针 TaqMan探针是一段5’端标记报告荧光基团(R),3’端标记淬灭荧光基团(Q)的寡核苷酸,其序列与模板DNA中的一段完全互补。当探针单独存在时,由于荧光共振能量转移的发生,R的荧光受到Q的猝灭。在PCR过程中,由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用,使探针的5’端的R被切断,加大了与Q的距离而使荧光恢复。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此,Taqman探针检测的是积累荧光。 TaqMan探针 评价 优点： 荧光信号强 与其它探针相比设