J-32 基因地工程制药技术 第三节 基因工程药物生产上游技术.docVIP

江苏农林职业技术学院讲稿 第 PAGE 1 页 共 NUMPAGES 7 页 PAGE 第三十二讲 授课内容 第六章 基因工程制药技术 第三节 基因工程药物生产上游技术 授课时数 2 教学目标 了解基因工程制药上游技术概况 教学重点 目的基因获得与重组、基因转移与表达 教学难点 基因转移与表达 教材教具 教学内容（含教学步骤、时间分配、教法学法、作业布置等） 导入新课： 基因工程制药是一个很复杂的过程，可分为上游技术和下游技术两个阶段。上游过程主要包括分离目的基因、基因转移与表达、构建工程菌，以及发酵条件摸索和中试放大等过程，以实验室研究为主。下游阶段是将实验室研究成果产业化、商品化，包括工程菌大规模发酵参数的优化确立、高效分离工艺的研发、分离纯化的优化控制、高纯度产品制备技术等。 第三节 基因工程药物生产上游技术 一、目的基因的获得 1、直接提取——基因组文库 基因是存在于细胞中DNA片段，在对其进行操作之前，应先行将其分离出来。对于细胞的总DNA的提取最常用的方法是碱抽提法。基本步骤如下： 细胞或组织匀浆（4℃/无菌设备） 细胞裂解：加10%SDS/溶菌酶，振荡混合，65℃ 加8M醋酸钾振荡混合，冰浴60分钟。 离心去除沉淀，取上清液。 加入等体积的氯仿和SS-酚，轻轻振荡混合，静置使液层分开。 取出上层液，弃去下面的氯仿层。 再加同样体积的氯仿继续抽提，同样弃去氯仿层。 在水相中加入乙醇（70%乙醇/100%乙醇），沉淀DNA。重复一次。 取沉淀，略干燥；用TE缓冲液溶解，4℃ 抽提过程中值得注意的常见问题有： （1）细胞破碎过程要温和，以免DNA被机械破碎。可采用溶菌酶消化细胞壁，去污剂溶解细胞膜。 （2）加入EDTA以络合Mg2+,其中Mg2+ 是DNA酶降解DNA所必需的。 （3）细胞破碎抽出核酸后，可用RNA酶处理除去RNA。 （4）去除杂质蛋白质可用蛋白质酶K降解。 （5）乙醇沉淀DNA后用Tris-EDTA缓冲液4℃ （6）所有操作宜在4℃ （7）对于细胞器和病毒中DNA，如质粒，最好先分离出细胞器，再用特殊方法处理。 分离质粒载体DNA有多种方法，碱变性法仍是最流行的分离纯化方法。当pH=12.0～12.5时，通过加热，线性DNA会被变性，而cccDNA不会被变性。如果变性处理的质粒和染色体DNA混合物，通过致冷或恢复中性pH值便会迅速复性。然而，复性过程中，染色体分子会聚集成网状结构，经离心分离，染色体分子与变性的蛋白质和RNA一起沉淀下来，滞留在上清液中的质粒分子则可用酒精沉淀法收集。 如果需要高纯度的DNA，可以采用氯化铯密度梯度超离心法。 2、逆向转录 取得基因的另一个常用的办法是通过与所需要的蛋白质对应的mRNA逆向转录。首先分离mRNA，然后在逆转录酶的作用下，合成一段与该mRNA互补的DNA，这就是所需要的基因DNA。 mRNA的特点是在细胞中存在的时间很短暂，半衰期在小时甚至分秒计，所以它的提取要求也是小心仔细，以免破坏其结构。一般步骤如下： 细胞破碎：液氮冷冻的组织在提取液中研磨成粉末。 氯仿处理：加等体积的氯仿以除去匀浆液中的蛋白质。重复处理。 沉淀：加入3mol/L的NaCl和乙醇，-20℃ 清洗：沉淀经70%乙醇，重复多次。 重溶：RNA沉淀用TE缓冲液重新溶解，即为mRNA样品。 获得的mRNA在相应的逆向转录反应体系中进行逆转录。核心催化酶是逆转录酶，也叫反转录酶，准确的称呼是RNA指导的DNA聚合酶。 3、人工合成 一般先测定出所需蛋白质的氨基酸顺序，然后根据三联体密码学说，推断出其基因的碱基顺序，通过化学方法合成所需的基因。现在常用DNA合成仪，但此仪器价格昂贵，不是一般实验室可以使用的。 二、基因重组技术 1973年，美国斯坦福大学以科恩（S. Cohn）教授为首的研究小组把两个不同的质粒拼接在一起，组合成一个嵌合质粒，导入大肠杆菌。结果发现这种嵌合质粒能在其中复制并表达双亲质粒的遗传信息。这就是基因重组技术，也是基因工程成功的第一个例子。从此，科学家们撞开了从分子水平上直接改造生物的大门。这一成功激发了人们对基因操作的巨大热情，并接二连三地攻克了一个又一个难关，使基因重组技术逐渐趋于成熟，并进入实用化阶段。 （一）基因的剪切——限制性内切酶（restriction enzyme） 基因重组技术的关键步骤是在体外把所需的基因切割下来，以便进行必要的拼接，或将其连接到载体上去。这种切割要求特殊的工具酶——限制性内切酶。 限制性核酸内酶简称限制酶，是一类对核酸链特定位点专一性很强的核酸内切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上。它们在基因的分