生物物理课不9-1.pptVIP

膜蛋白的晶体学研究;生物大分子结构研究的方法概况 (1)X－光晶体衍射（X－ray）：这是目前生物大分子结构解析最有效的一种方法，它有赖于高度有序的三维晶体的获得。 (2)核磁共振（NMR）：这种方法已成功地用于菌视紫质及有机溶剂中细菌F1F0－ATP酶的F0膜功能区的C单元的结构解析。 (3)电镜（EM）二维晶体及三维重构： 目前，电子晶体学阐述的结构达到3埃的分辨率。;已测定的膜蛋白晶体结构(原子分辨水平);蛋白质晶体的类型 由于分子之间相互作用的性质不同，蛋白分子可以形成三种不同类型的晶体，即三维晶休、二维晶体和二维晶垛(stacks of 2D crystals)。其中，维系分子之间形成三维晶体的相互作用主要来自亲水相互作用；而在二维晶体中，膜包埋区域疏水相互作用是维系晶体结构的主要作用；对二维晶垛，膜包埋区域仍是疏水作用，而层间则是亲水作用。;膜蛋白三维结晶; 去污剂-蛋白微团 形成的三维晶体;晶体生长现象 从溶液中结晶是一个很普遍的自然现象，对于小分子、无机盐、水溶性蛋白和膜蛋白而言，结晶的原理都是相同的。 为了使体系发生结晶，必需通过改变一个或者更多的物理参数如浓度、温度、离子强度等来达到溶液的过饱和状态。通常而言，这个过程变化越缓和，结晶过程就越好控制，高度有序的晶体就更易于得到。 结晶包括两个连续的过程：成核和晶体生长。成核过程是一个可逆的过程。当晶核长大到一定程度时，它将进一步不可逆地长大，形成一个新相，进而形成稳定的晶体。 从微观角度而言，每一个分子具有六个自由度，三个水平和三个旋转自由度，它们通过有序的堆积使体系的熵减少。在蛋白经过有序堆叠形成晶体的同时，相邻分子间形成新键，进而降低体系的自由能，这是形成结晶的驱动力。;水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异： 水溶性蛋白和膜蛋白在结晶性质上的差异主要是由其溶解性存在差异的结果。溶解性的差异往往由蛋白的表面性质、蛋白的取向极性，或者它们两者共同造成的。 水溶性蛋白暴露出极性表面，在水溶液中各相同性。整合膜蛋白是双亲性的，一般是垂直插过脂双层膜，它具有锚在膜上的疏水核心，以及指向胞质侧和胞外侧的两个极性表面。 尽管膜蛋白难于形成三维结晶，经过艰苦的摸索也有成功的例子。首先报道的菌视紫质和红细胞膜孔蛋白的三维结晶是从水溶性去污剂溶液中得到的。最近，在膜蛋白的三维结晶中又引入了两个新的概念，同时这两种新途径都获得了高分辨率的晶体结构。其中之一是细菌色素C氧化酶与其构象专属性单克隆抗体的Fv片段采用共晶方法得到的；另外一个是通过脂立方相技术得到的。;膜蛋白三维结晶需要分子伴侣： 1)．去污剂： De Grip在研究质子受体视紫质和视蛋白在不同去污剂溶液中的稳定性时发现以下经验性规则： (1) 在分子大小相当时，非离子去污剂比兼性离子去污剂要温和。 (2) 在同系物中，烷基链较长的去污剂较温和。 (3) 在同样烷基链的情况中，头部体积越大的去污剂越温和。 在Rhodopseudomonas viridis 的反应中心的晶格中发现，极性的相互作用发生在蛋白之间、蛋白与胶束之间以及胶束之间。去污剂的种类和大小对于这些相互作用来说是很关键的，对于一定的膜蛋白其选择范围很狭窄。 膜蛋白三维结晶中往往采用一些烷基链较短，头部较小的去污剂，这样能形成较小的胶束以使得膜蛋白本身具有最大的极性接触面积来形成结晶。;膜蛋白三维结晶需要分子伴侣： 2).添加剂 在很多情况下，中性或带电的双亲小分子能改善膜蛋白的三维结晶或是其结晶所必需。 在光合作用反应中心的结晶中，添加剂的加入使得与反应中心相互作用的去污剂的数量减少。在膜孔蛋白的结晶中，辛基寡聚还氧乙烯的加入可减慢结晶的速度。苯脎脒定的加入使得菌视紫质在含OG的溶液的溶解增多。异丙醇的加入可增大菌视紫质的晶体尺度。而且有些添加剂能自身结晶从而为膜蛋白的结晶形成晶核表面。 Michel 提出双亲小分子的概念，去污剂/添加剂所形成的胶束比纯去污剂所形成的胶束要小一些，这样更有利于胶束在晶格中的堆积。Garavito 指出添加剂能提高胶束的变形性，使得它们更适合于在晶格中的堆叠。;膜蛋白三维结晶需要分子伴侣： 3). 沉淀剂 在膜蛋白的三维结晶中，沉淀剂的使用受到较大的限制：大多数情况下采用PEG 和高浓度的盐。PEG通过竞争体系中的水分子而改变溶质的结构，PEG浓度的提高可引起沉淀或相分离，PEG也能降低OG的共溶边界。 在膜蛋白结晶中常采用高盐浓度。如硫酸铵、磷酸铵等，它们能改变去污剂的溶解性。如在菌视紫质的立方相结晶中常采用磷酸钠或磷酸钾作为沉淀剂。;膜蛋白三维结晶