基因工程菌的发酵..ppt

* * 第六节 基因工程菌的稳定性 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略 基因工程菌的稳定性 基因工程菌的遗传不稳定性的表现 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式： 结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing） 基因工程菌的稳定性 基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 基因工程菌的稳定性 基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 基因工程菌的稳定性 重组质粒的逃逸率 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。 重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重 组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝 数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧 影响基因工程菌稳定性的因素 载体的选择 遗传特性 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基 生长速率 发酵工艺 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达 基因工程菌的稳定性 提高基因工程菌稳定性的策略 改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因） 基因工程菌的稳定性 培养基 一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。 培养条件对基因工程菌稳定性的影