基因突变技术提高phya植酸酶在毕赤酵母中表达量及热稳定性的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

附件一论文独创性声明 附件一 论文独创性声明 本人郑重声明t所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 7孑移7 汐r年f 1月叫日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 西移 矿r年fz月Ⅳ日 导师签名 pr每，诵z，fB 中文摘要’植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂，其使用效果已在世界范围内得到了确证。 中文摘要’ 植酸酶作为单胃动物的饲料添加剂，其使用效果已在世界范围内得到了确证。 但是，目前植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限，主要原因在于：(1)植酸酶 基因工程菌的产酶量有待进一步提高；(2)植酸酶的热稳定性欠佳不能完全满足饲 料加工、贮藏的要求。目前，蛋白质工程技术已成为修饰和改造天然酶的有效手段， 为植酸酶产量的提高和热稳定性的改善开辟了新的途径。本研究在对本课题组已注 册的植酸酶phyA基因核苷酸序列及氨基酸序列分析的基础上，通过对phyA基因进 行同义突变、定点突变以及结构延伸突变，获得在毕赤酵母中高效表达并且热稳定 性良好的植酸酶，其结果主要如下： 1、对来源于本课题组自主分离的黑曲霉N25(Aspergillus nigerChina Strain)的 植酸酶基因phyA(GenBank：基因注册号为AF218813，蛋白质序列号为AAF25481) 进行PCR介导的定点突变。在不改变其所编码氨基酸条件下，选用毕赤酵母偏爱的 密码子对该基因保守序列中第81位和第85位的Arg密码子进行同义突变，构建了 含j下确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyA 。电击转化毕赤酵母GSll5，经筛选培养 基MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定，筛选出突变的高酶活酵母转化子2株。 这2株转化子的Southernblotting结果显示突变基因phyA“以单交换方式单拷贝整合 到酵母染色体DNA中；表达产物的SDS．PAGE分析表明，重组酵母中的植酸酶能有 效分泌和表达，其酶蛋白分子大小为70．15kD；转化子酶活测定结果可知，经密码子 优化的突变重组酵母的酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子。密码子优化 后的突变重组酵母株PP-NPm．8于麦芽汁培养基中诱导36h后，酶活力可达47600 U 。ml～，比未优化重组酵母株PP-NP一2(23667U·ml‘1)提高了1．01倍，经十代传代实 验证实重组转化子遗传稳定性良好。 2、采用反向长距离PCR技术对上述重组酵母PP，NPm-8的植酸酶突变基因phyA“ 进行PCR介导的定点突变，即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y)，将 其354．358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(1354M，L358F)， 得到了两个突变体PP—NP”1(F43Y)及pp．Npm-2(1354M，L358F)。含突变基因的重 组表达载体pPlC9k-phyA”。，pPIC9k-phyA”2在毕赤酵母GSl 15中表达．对表达产物 ‘奉研究欹圈家“l五”最点科技攻关了课题(2002BA514A、12)及四川省科技厅随用雄础研究(N003JY029-029) 资助． 1 进行酶活性测定及热稳定性检测，结果表明：突变体PP—Nr1的最适反应温度比pp-NPm-8上升了3℃，75℃处理10min，热稳定性提高15％，比活力提高II％。PP-NP“。 进行酶活性测定及热稳定性检测，结果表明：突变体PP—Nr1的最适反应温度比 pp-NPm-8上升了3℃，75℃处理10min，热稳定性提高15％，比活力提高II％。PP-NP“。 的最适反应温度未改变，热稳定性比PP．Npm-8仅提高3％，比活力降低6．5％。对突 变前后的植酸酶空间结构进行比较预测，发现突变氨基酸phe43与空间位最相邻的 Asn416之间形成氢键，增强了酶的热稳定性。此外，摇瓶培养及酶活测定表明，突 变体PP-NP”1、PP-NP”2与突变重组酵母株PP．NPm．8的表达量～致。 3、将上述重组酵母PP—NPm 8的植酸酶突变基因phyA“重组于大肠抒菌表达载 体pET-30b(+)上，以重组表达载体pET30b-FphyA”为摸板经PCR