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损伤反应性星形胶质细胞对成年大鼠压迫性脊髓损伤的再生作用 西安交通大学第二医院骨科专 业：外科学研 究 生：杨平林  导 师：贺西京 教授 研究背景 神经干细胞在成年动物中枢神经系统（central nervous system，CNS）中的存在，打破了CNS损伤后神经元不能再生的观念，使CNS损伤修复成为可能。近年来研究表明，在成年哺乳动物的大脑皮层、海马齿状回、室管膜下层、纹状体、脊髓中央管室管膜区等部位证实有神经干细胞存在。 研究背景 和前脑、海马甚至视网膜相比，有关成年哺乳动物脊髓中神经干细胞的研究却远远滞后，脊髓神经干细胞（可能存在于脊髓中央管周围的室管膜区）的培养却一直到1996年才得以成功。随后又发现，神经干细胞/神经前体细胞广泛分布于整个脊髓实质，包括灰质和白质，并不是从脊髓中央管室管膜周围产生并迁移而来的。 研究背景 最近又有研究表明，某些星形胶质细胞中存在着干细胞，可作为神经干细胞的来源，尤其是位于神经生发区（如SVZ和SGZ等）的胶质细胞具有干细胞特性。随后又有研究表明，来自非神经元生发区（如脑和脊髓的皮质）的胶质细胞也具有多向分化潜能并能产生神经元，尤其在损伤等疾病区域及邻近区域。 存在和尚需解决的问题 中枢神经系统损伤最常见的是反应性星形胶质细胞增生，在损伤修复过程中，其具有数量多、出现早、变化快、易分化、易形成瘢痕等特点，这说明损伤反应性星形胶质细胞增生对CNS损伤修复存在有利和不利的双重作用。那么在反应性星形胶质细胞增生过程中，某些或某时期反应增生性星形胶质细胞是否共同表达特异性神经干细胞标志物—巢蛋白（Nestin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP），是否具有干细胞特性，非神经元生发区的损伤反应性星形胶质细胞是否可以作为神经干细胞来源？目前都尚未见详细报道，有必要进一步研究。 存在和尚需解决的问题 在文献复习中，我们知道某些星形胶质细胞中存在着干细胞，可作为神经干细胞的来源。 由此，我们推测脊髓损伤后星形胶质细胞高表达Nestin很可能预示着它们发生了“去分化”而处于相对“幼稚”的干细胞或前体细胞状态。这些细胞从位置上可简单地分为两类，一类位于脊髓中央管周围；另一类则广泛分布在损伤区附近的脊髓实质中（包括脊髓白质）。 研究目的及意义 为此，本实验利用动脉瘤夹压迫法建立脊髓损伤动物模型，利用巢蛋白（Nestin）与胶质酸性纤维蛋白（GFAP）作为神经干细胞特异性标志物，应用免疫组织化学和免疫荧光双标技术结合激光共聚焦显微镜、图像分析系统、流式细胞仪以及细胞培养技术，观察了脊髓损伤后不同时期损伤、不同部位Nestin与GFAP的表达变化、细胞类型及其相关性，以及Nestin+/GFAP+共存细胞表达高峰期（损伤后3~7天）的脊髓组织（剔除中央管周围室管膜区）的增殖、分裂和分化能力。 研究目的及意义 探讨损伤反应性星形胶质细胞对成年大鼠压迫性脊髓损伤的再生作用，以阐明损伤反应性星形胶质细胞增生与神经干细胞标志物表达的关系，即星形胶质细胞与神经干细胞是否对脊髓损伤有反应；损伤反应性星形胶质细胞是否具有神经干细胞特性，可作为内源性神经干细胞来源？从而为寻找干细胞资源和中枢神经系统损伤修复提供新思路和理论依据。 成年大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生和Nestin表达的相关性及意义 Nestin是神经干细胞或前体细胞所特有的一种中间丝蛋白，多出现于早期原始分化的细胞，目前已被广泛用于神经干细胞的鉴定。GFAP是星形胶质细胞的特异性蛋白和骨架成分之一，并可作为其及反应性星形胶质细胞的特异性标记。本部分采用动脉瘤夹压迫法建立成年大鼠脊髓损伤动物模型，着重分析压迫性脊髓损伤后不同时期、不同部位Nestin和GFAP的表达、共表达变化及其阳性细胞的细胞类型。 实验动物与分组 成年8周龄SD大鼠48只，清洁级，由西安交通大学医学院动物中心提供，雄性，体重200~250克，随机分为正常对照组（6只）和模型组（42只），然后于造模后1d、3d、5d、7d、14d、28d和 56d分成7小组，每小组6只。所有动物均在室温下饲养。 动物模型的建立 利用动脉瘤夹压迫法建立成年大鼠脊髓损伤动物模型：用3%的苯巴比妥钠经腹腔麻醉（30mg/kg），无菌条件下，以胸8椎体为中心暴露脊髓，然后以胸9（T9）脊髓节段为中心，在显微镜帮助下用宽度1.2mm，压迫力约为98牛顿（N）的动脉瘤夹压迫脊髓3分钟。术后人工按压膀胱协助排尿每日2次。 动物模型的建立 附 图 动物模型的建立 附图 神经功能评定 T8-10脊髓损伤后不同时期神经功能评定：①采用Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)评分标准评价运动功能。②采用HE和甲苯胺蓝染色观察脊