《生物技术概论》课音程总复习.pptVIP

基因工程的一般流程 目的基因的获取 载体的构建 体外重组 导入宿主细胞 筛选及鉴定重组子 1.限制性内切酶 2.连接酶 3.末端修饰酶 3.微生物细胞工程 酶生物合成的模式 双向电泳技术 第一向等电聚焦（IEF）电泳：利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质的电泳方法。用缓冲液水化 第二向SDS：SDS，巯基乙醇，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，样品中的蛋白质成分按照蛋白质分子量的大小加以分离。 通过染色，进行蛋白质计算机软件分析。 目前蛋白质工程研究的主要领域，研究程序一般如下： （1）分离纯化得到0.1－1.0mg纯目的蛋白质 （2）测定其部分肽段的一级结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针 （3）利用该探针从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因 （4）通过表达载体获得较大量(0.1－1.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案 （5）基因进行定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化大量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子 蛋白质组学（Proteomics） “Proteome”最终概念是指：一个基因组，一种生物或一种细胞或组织所表达的全套蛋白质。 蛋白质组学（Proteomics)：以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的一门科学领域。 功能蛋白质组（Functional Proteome)：指在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。 功能蛋白质组学（Functional Proteomics）：研究细胞内与某种功能有关或在某种条件下的一群蛋白质。 * 现代生物技术的概念 技术手段（种类） 第一章 绪 论 第二章 基因工程 （Gene Engineering） 基因工程中常用的工具酶 基因克隆载体的概念： 作为基因克隆载体一般应具备的条件： （1）多克隆位点 （2）自我复制；或能整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制。 （3）选择标记基因 （4）克隆载体必须是安全的 （5）载体DNA分子应尽可能小，插入片段的范围有选择性 基因工程中常用的载体 载体类型 严紧型质粒和松弛型质粒 lacZ蓝-白斑筛选 （1）穿梭质粒载体（shuttle vector）： （2）T－克隆载体和U－克隆载体 （3）Ti质粒载体 （4）柯斯质粒载体 （5）YAC \BAC 目的基因片段的获取 1 目的基因的来源 2 获得目的基因的途径 2.1 限制性酶切法； 2.2 PCR法； 2.3 化学合成法； 2.4 基因组文库或cDNA文库法； ①模板DNA的变性：95℃ ②模板DNA与引物的退火(复性)：60 ℃ ③引物的延伸：72 ℃ 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 电泳 PCR基本过程（反应步骤）： 目的基因导入受体细胞 方法： 转化：通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并整合到受体染色体组，在受体内稳定维持和表达的过程。 转染：如果进入受体细胞的外源DNA分子是病毒（噬菌体）的DNA,则把此过程称为转染。 转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。 重组子的筛选 筛选方法： （一） 根据载体选择标记基因筛选 抗性筛选、蓝白斑筛选 gus 基因、荧光素酶基因luc、绿色荧光蛋白基因gfp， （二）根据报告基因筛选转化子 （三）根据形成噬菌斑筛选转化子 1 根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据重组DNA分子大小鉴定重组子、根据重组DNA分子酶切图谱鉴定、PCR法、DNA杂交、应用DNA芯片鉴定重组子、根据DNA核苷酸序列鉴定重组子 重组子的鉴定 2 根据目的基因转录产物（mRNA）鉴定重组子 Northern杂交 RT-PCR： 3 根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）鉴定重组子Western 基因工程的一般步骤(目的基因未知） 生物材料 RNA DNA mRNA cDNA文库 基因组文库 人工合成 目的基因 克隆载体 重组DNA 受体细胞 克隆子 转基因生物 第三章 细胞工程 第一节 细胞工程基本知识与基本技术 第二节 植物细胞工程 第三节 动物细胞工程 第四节 微生物细胞工程 第二节 植物细胞工程 1. 植物组织培养的基本过程： 预备阶段： 诱导去分化阶段： 继代增殖阶段： 生根发芽阶段： 移栽成活阶段: 2.1 植物组织培养