基因枪轰击法和睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验分析-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

本文是“十二五”转基因生物新品种培育重大专项子课题 “优质转基因肉羊新品种培育”的部分研究成果 （项目编号：2012ZX08008-003） I I 基因枪轰击法和睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的 实验研究 摘 要 转基因动物在生命科学、医学和生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景, 因此 科学家们一直在探索一种更简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。 为了探讨基因枪法和睾丸输出管注射法在建立转基因小鼠的可行性，我们分别进行 了两个实验。 实验一：基因枪轰击法在建立转基因小鼠上的实验研究。首先，挑选清洁级 40 日 龄雄性 KM 小鼠 20 只，雌性 KM 小鼠 60 只。将需要导入的质粒 eGFP-C1 进行转化提取。 然后准备基因枪设备， 清洗发射管，清洁高压管道， 准备消毒操作试剂、工具、设备。 包覆 DNA 微弹，准备受体。最后准备金粉的清洗，DNA 子弹的制作。子弹包装完成后， 就开始准备基因枪轰击。我们先用基因枪轰击 T293 细胞,轰击后 48 小时观察，T293 细 胞出现绿色荧光，证明绿色荧光蛋白在 T293 细胞中表达，基因枪轰击细胞可行，可以 进行下一步实验。然后开始准备基因枪轰击小鼠的睾丸，先将小鼠用腹腔注射 0.1 mL 1% 戊巴比妥钠麻醉，待小鼠麻醉后，固定四肢于木板上。将阴囊剪开一个小口，将睾丸拉 出。将基因枪对准小鼠睾丸上方 3-5 cm 处轰击。小鼠睾丸基因枪轰击后，一周以后， 取小鼠睾丸培养支持细胞，以观察荧光。睾丸支持细胞培养 48 小时后观察出现绿色荧 光，这表明 eGFP-C1 在小鼠睾丸的支持细胞中表达。另外取小鼠睾丸进行石蜡切片的制 作，观察到曲细精管石蜡切片出现了彩色荧光，进一步表明绿色荧光蛋白在小鼠睾丸曲 细精管中表达。基因枪轰击小鼠睾丸 10 天后，挑选 10 只健康的小鼠和雌鼠按雌雄比例 3:1 合笼，待生出仔鼠后，对全部出生的小鼠提取尾尖 DNA 进行 PCR 检测，共出生小 鼠 314 只，将这 314 只小鼠，全部提取尾尖组 DNA 织做 PCR 鉴定后，有 12 只显示阳 性。阳性率为 0.038﹪。通过本实验，验证了通过基因枪轰击的方法可以建立转基因小 鼠。 实验二：睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的实验研究。首先，质粒EGFP-C1的转 II II 化与提取同实验一。然后对T293细胞进行转染实验，48小时后观察到绿色荧光表达 非常好，可以进行下一步的实验。睾丸输出管注射用玻璃针的制作好后，可以进行注射， 将注射用转染液配制好，按脂质体试剂Lipofectamine2000说明书将将载体eGFP-C1与脂 质体混合。麻醉小鼠，注射时浓度一般为1%的戊巴比妥钠，腹腔注射0.1 mL。找出输出 管将配好的转染液注射进去，注射完后立即取一只睾丸进行石蜡切片的制作，观察到曲 细精管全部变蓝，这表明转染液已经注射进入曲细精管。睾丸注射一周后取睾丸培养支 持细胞，观察到绿色荧光，这表明eGFP-C1已经在小鼠睾丸支持细胞中表达。睾丸注射 10天后挑选健康的雄鼠10只，按雌雄比例3:1合笼。生下仔鼠后提取全部小鼠的尾尖组织 DNA进行PCR检测，共产下仔鼠327只，将全部仔鼠尾尖组织提取DNA做PCR鉴定后， 获得阳性仔鼠17只，转基因鼠阳性率为0.052﹪。通过本实验证明通过睾丸输出管注射法 可以建立转基因小鼠。 关键词：小鼠，转基因，基因枪，睾丸注射，输出管。 PAGE PAGE IV Construction of transgenic mice by testicular efferent duct injection and Gene gun Abstract Transgenic animals have a wide range of research and application prospects in the field of life sciences, medicine and biopharmaceutical scientists has been exploring a more simple, economical and efficient transgenic approaches. To explore gene marksmanship and testicular output tube injection in the feasibility of the establishment of the transgenic mice, we were two experiments. Experiment one: Bombardment experimental study on the establishment of