基因修饰增加枯草芽孢杆菌脂肪酶的分泌-生物化工专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 摘要 枯草芽孢杆菌（B. subtilis）表达和分泌的胞外脂肪酶（LipA），是分子量 最小的碱性脂肪酶，有重要的应用价值。本文以提高脂肪酶分泌水平为研究目 的，考查了宿主菌及胞外蛋白缺失，TatAdCd 转位酶过表达对脂肪酶发酵的影 响。 在 B. subtillis 168 中，通过缺失胞外中性蛋白酶（NprE）和碱性蛋白酶 （AprE），构建了 B. subtilis BNA 菌株。用脂肪酶表达质粒 pHP13L，分别转化 B. subtillis 168、BNA 和 DB104 菌株，分别筛选出分泌脂肪酶的 168/pHP13L、 BNA/pHP13L 和 DB104/pHP13L 菌株。摇瓶发酵显示，B. subtillis BNA 发酵液中 的脂肪酶活性是 168 菌株的 1.5 倍，168 菌株是 DB104 菌株的 2.5 倍。168 菌株 发酵液中的脂肪酶活性极不稳定，达到最大值后迅速下降。结果表明，B. subtillis 168 比 DB104 更适宜作为脂肪酶发酵的宿主菌；主要胞外蛋白酶的缺失，有利 于维持分泌脂肪酶的稳定。 在 B. subtilis BNA 和 DB104 菌株中，分别缺失胞外蛋白 YolA、YolB、XynA、 YncM 和 Csn，并进行质粒 pHP13L 转化，构建 BNA 和 DB104 系的衍生菌株 BNAY2-5/pHP13L 和 BDY2-5/pHP13L。摇瓶发酵显示，这些衍生菌株胞外蛋白 缺失的数量与其脂肪酶发酵单位，以及发酵液中脂肪酶的稳定性均呈正相关。缺 失 5 个胞外蛋白的 BNAY5/pHP13L 和 BDY5/pHP13L 菌株，分别在同系菌株中， 脂肪酶发酵单位最高，分别为 230 和 170 U/mL；并且脂肪酶的最大活性可持续 到发酵 60 h。结果表明，在产脂肪酶的 B. subtilis 中，缺失分泌量较大的依赖 Sec 途径分泌的胞外蛋白，能够在一定程度上减少 Sec 途径的分泌压力，有助于提高 脂肪酶的分泌水平。 分别在 B. subtilis BNA 和 BNAY5 菌株中，在染色体 sacB 基因位点，整合过 表达 tatAD-tatCD 操纵子，构建了 B. subtilis BNAT/pHP13L 和 BNAY5T/pHP13L 菌株。摇瓶发酵显示，菌株 BNAT/pHP13L 的脂肪酶发酵单位达到 290 U/mL， 较出发菌提高 1.35 倍；而对菌株 BNAY5T/pHP13L，脂肪酶发酵单位没有明显提 高。结果表明，过表达 TatAdCd 转位酶，能够显著提高脂肪酶的分泌量或分泌 速率，但是可能与 5 个胞外蛋白的缺失是等效的。 关键词：脂肪酶 胞外蛋白 Sec 途径 Tat 途径 tatAD-CD 操纵子 枯草芽孢杆菌 ABSTRACT The extracellular lipase (LipA) of B. subtilis, which is an alkaline lipase with the minimum molecular weight, has important value in application. In this work, some critical factors that influenced the secretion of the lipase were studied, including the host strains, deficiencies of a number of extracelluar proteins and the overexpression of tatAD-tatCD operon in B. subtilis. First, the extracellular neutral protease (NprE) and the alkaline protease (AprE) were deleted in B. subtilis 168 and obtained recombinant B. subtilis BNA. Then the plasmid pHP13L for expression of lipsae was transformed into B. subtillis 168, BNA and DB104, respectively. The activity and stability of lipase in the medium of B. subtillis BNA were significantly higher than them of B. subtillis 168 and