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实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 鲁东大学 实验目的 1.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。 2.检测PCR结果。 实验原理 1. DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 核酸为两性分子，在pH 3.5时，碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电； pH 8左右时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有相同的电荷密度，其电泳行为线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。 2. 琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改变孔径的大小，起到分子筛的作用。 琼脂糖凝胶电泳 200bp—50kb（分离范围广、方便） DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 3. 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分碱基对子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 EB结构与核酸碱基相似，容易插入DNA中，因而其有强的致癌性。 器材与试剂 1.实验器材 电泳仪、电泳槽、凝胶紫外透射仪、解剖刀、台式高速离心机、Eppendorf管、移液抢、恒温水浴锅、一次性手套、三角烧瓶 2.试剂 琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。 本实验配制 1％ Agrose： 1g Agrose、 50～100ml 0.5×TBE、 核酸样品 DNA marker DL2000 电泳缓冲液：本实验选用TBE 6×上样缓冲液（ Loading buffer ）： 4℃贮存。增加样品密度，使样品带颜色，起指示作用。 0.25% 溴酚蓝、0.25% 二甲苯青FF、30％ 甘油水溶液 10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液，棕色瓶室温保存。终浓度是0.5μg/ml。 操作步骤 1、凝胶准备：用0.5×TBE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB（终浓度0.5μg/ml），并轻轻混匀。 2、胶床准备： ①取出洗净并晒干的胶床和梳子 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。 3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm。 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。 5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。 7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。例如，5微升的DNA样品+1微升的上样缓冲液，以此类推。 6、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜。 8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。 9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：接通电泳槽与电泳仪的电源，调节电压100V 30min,当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶 （手套拿取凝胶）。 11、电泳结果分析： 紫外检测仪直接观察电源条带；凝胶成像分析系统处理。 影响迁移率的因素 DNA分子的大小 琼脂糖凝胶的浓度 DNA的构象 所加电压 一般5V/cm 电场方向 染料的存在与否 电泳缓冲液的组成 注意事项 1. 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使凝胶盘变形。 2. 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔。 3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。 4.EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔，紫外线照射不宜太久。 思考题 1.影响核酸在琼脂糖凝胶电泳中迁移速率的因素有哪些？ 2.电泳中加入Loading buffer的作用是什么？