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* * * * * * * * * 黄文锋 文献汇报之 染色质免疫沉淀（ChIP）技术及其应用 2009年7月27日 主要内容 何谓ChIP实验技术 ChIP技术基本步骤及注意事项 ChIP实验技术的应用 何谓ChIP实验技术 染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP）是 研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特 异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。 是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的 蛋白质的重要方法。 是深入分析癌症，心血管等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。 何谓ChIP实验技术 在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理， 将染色质切成小段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相 结合的DNA片段沉淀下来。通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白 原理 质与DNA相互作用的信息。 何谓ChIP实验技术 主要内容 何谓ChIP实验技术 ChIP技术基本步骤及注意事项 ChIP实验技术的应用 ChIP技术的基本步骤 基本步骤 优秀幻灯片 DNA的分析鉴定 染色质的断裂 细胞的固定 染色质免疫沉淀 交联反应的逆转及DNA的纯化 细胞的固定 交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时， 具体时间根据实验而定。 ChIP实验利用甲醛在生理状态下使蛋白质-DNA交联， 形成生物复合体，避免了DNA结合蛋白在染色质上的 重新定位，或者在后续的生化分离中丢失。 甲醛是一种高分辨率的可逆的交联剂 染色质结构本身是动态的， 并且DNA与非组蛋白相互作用常是瞬时的。 注意事项 交联时间过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响实验结果。 交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。 甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。 ChIP技术的基本步骤 基本步骤 优秀幻灯片 DNA的分析鉴定 染色质的断裂 细胞的固定 染色质免疫沉淀 交联反应的逆转及DNA的纯化 染色质的断裂 超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引 起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。 交联后的染色质可被超声波切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电 泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。 注意事项 在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的 超声程序，保证低温。 超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生 泡沫。 总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。  ChIP技术的基本步骤 基本步骤 优秀幻灯片 DNA的分析鉴定 染色质的断裂 细胞的固定 染色质免疫沉淀 交联反应的逆转及DNA的纯化 染色质免疫沉淀 Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照 Input 对照 Input对照可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶 序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取 样比例换算出ChIP的效率。 在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。 Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经 过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。 必不可少的步骤 染色质免疫沉淀 Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照 Beads选择 Magna beads是近年来出现的一种新型beads，它使用方便， 不像Agarose beads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单， 而且免去了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推 出的Magna ChIP试剂盒就是采用这种Magna beads。  利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体 复合物，然后使用Agarose beads（琼脂糖小球）或Magna beads沉 淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段。再经过多次 洗涤，除去非特异结合的染色质后，用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复 合物。