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常见的生化与分子生物学技术 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力。 分离纯化的一般程序 　1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） 3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 　其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。 生物大分子的浓缩 沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。 盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等 。 吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。　　　　　　　　　　 超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。 透析浓缩法 减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。 冰冻干燥法 纯度鉴定 生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。 蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。 纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。 选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。 蛋白质、核酸的定性定量检测 核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。 同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。 电泳 带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。 电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的凝胶电泳。 等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。 4. 电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好 5. 温度 电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。 6.支持物 现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色等后续处理。 凝胶聚合的原理及有关特性 催化系统常用有两种： 过硫酸氨—TEMED化学催化聚合系统 此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。 核黄素—TEMED光聚合催化系统 此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。 聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。 所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺