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本节主要内容 λ噬菌体病毒载体 Cosmid载体 M13单链噬菌体病毒载体 噬菌粒载体 植物病毒载体 CaMV(花椰菜花叶病病毒)克隆载体 TMV(烟草花叶病毒)克隆载体 动物病毒载体 SV40克隆载体 反转录病毒克隆载体（劳斯肉瘤病毒） 腺病毒克隆载体 痘苗病毒克隆载体 杆状病毒表达克隆载体 病毒：一类超显微的非细胞生物, 每一种病毒只含有一种核酸 （DNA和RNA不会并存于同一病毒颗粒中） 特点： 只能在活细胞内营专性寄生; 离体条件下,以无生命的化学大分子状态存在 对抗生素不敏感，对干扰素敏感 病毒克隆载体应用的局限性：温和性病毒和烈性病毒都存在严格的宿主专一性 部分病毒的性质 三类典型形态的病毒： 噬菌体的生命周期分为: 溶菌周期和溶源周期 烈性噬菌体的繁殖途径Phage reproductive cycle 温和噬菌体的繁殖途径 λ噬菌体与λ噬菌体载体的特点： c、λ噬菌体在宿主体外与蛋白质结合包装成为含双链线状DNA的颗粒，分为四个区。 代表性λ噬菌体载体 插入型载体(insertion vectors)：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点 （只能承受10kb以内的小片段外源DNA的插入，广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆） Cosmid克隆载体 cosmid（cos site-carring plasmid）： 人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 柯斯质粒载体的特点： 1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒） 2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因） 3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达45kb左右） 4）具有与同源序列质粒进行重组的能力 广泛应用于基因组DNA文库的构建 柯斯克隆（cosmid cloning） 理论依据： 1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点) 2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的 3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去 M13噬菌体 M13噬菌体 6.4 kb单链环状正链DNA基因组 作载体的优点： 1) RF DNA 和SS DNA都可转染E.coli，产生噬菌斑； 2) 无包装限制问题（可6倍于M13基因组）； 3) 复制以双链环形DNA为中间媒介； 4）易测出外源DNA的插入方向； 5）可产生能直接测序的单链DNA分子。 构建M13噬菌体克隆载体的策略和途径 详见第二版 P116 噬菌粒载体（phagemid vector) 噬菌粒载体的特点 （1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA， 可克隆高达10 kb的外源DNA；拷贝数高； （2）有ampr 等基因作为选择记号；可用组织化学显色反应 筛选重组子；存在多克隆位点； （3）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源 基因可按质粒一样复制； （4）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主 细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒 分泌到培养基中。 （5）可直接对克隆的基因进行核苷酸测序 植物病毒载体 CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统：双链DNA病毒 TMV(烟草花叶病毒)载体系统：单链RNA病毒 其他植物病毒载体系统，如单链DNA病毒：番茄金黄花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、玉米线条病毒、小麦矮缩病毒，以及RNA病毒：雀麦草花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、番茄丛矮病毒等等。 CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统 花椰菜花叶病毒(caulimovirus，CaMV)：实际上是一个病毒群，已知有12个种。该病毒是为数不多的植物双链DNA病毒之一。 每个种的寄主范围都很窄，不感染豆类和单子叶植株， 它的寄主主要是十字花科植物（集中在芸苔属）和少数非十字花科（如茄科）植物。 构建CaMV载体的基本策略 自然条件下， CaMV感染宿主后，其DNA可以侵入植物细胞，但不插入染色体DNA，而是在细胞内复制、转录和翻译，但其结果是导致植物的病害。根据此特征，构建载体的基本策略是： SV40病毒 SV40病毒呈小型20面体，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、