人胚胎干细胞自我更新相关新基因的克隆及功能研究-病理学与病理生理学专业论文.pdf.docxVIP

博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 摘要 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)来源于胚胎发育囊胚阶 段的内细胞团，可以分化成机体三个胚层来源的所有组织细胞。自从1981 年由Evans和Kaufman等建立了首个鼠ES细胞系及1998年Thoinsoil等 分离得到人ES细胞以来，ES细胞研究得到了长足发展，目前仍是生命 科学研究热点之一。ES细胞的多向分化潜能使其在临床再生医学领域有 巨大应用前景，然而发挥ES细胞在临床治疗方面巨大作用的前提是如何 在体外扩增ES细胞，并保持其全能性。人ES细胞在体外培养时容易自 发分化，因此需要将其培养在胚胎成纤维细胞上或利用添加细胞因子的条 件培养基维持不分化，然而这些方法都较繁琐，不适合大规模培养，并且 可能造成外源性蛋白污染。要找到一种更适合更简便的人ES细胞培养条 件，首先必须要了解维持人ES细胞自我更新和多潜能性的分子机制。先 前文献研究报道显示：多种因素参与调控人ES细胞自我更新，其中包括 转录因子(Oct4、Nanog、Sox2等)，信号通路(TGFI]信号通路、WNT 信号通路、FGF和P13K信号通路等)，细胞周期调控因子，microRNA， 染色体稳定性及DNA甲基化等。Oct4、Nanog、Sox2是目前研究较多的 参与调控人ES细胞自我更新的转录因子，它们在人ES细胞中高表达， 通过抑制入ES细胞向某一胚层分化来维持人ES细胞多潜能性，并且它 们之间可相互作用形成复杂的转录调控环路，共同维持人ES细胞的多潜 能性。近来研究报道除上述几个关键基因外，人ES细胞中还存在其它已 知或未知基因参与其自我更新的调控过程，然而目前它们在人ES细胞中 的功能及调控机制远未阐明。为了探索和揭示除Oct4、Nanog、Sox2外 其它维持人ES细胞多潜能性的基因及其功能，更深入地阐明人ES细胞 自我更新的复杂机制，本课题开展了人ES细胞自我更新相关基因的高通 量筛选，并且进行了人ES细胞自我更新相关新基因的克隆和功能及转录 调控研究。 【人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析】 基因芯片为高通量基因表达研究提供了一个有利工具。本研究中采用 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2．0 Array芯片分析比较了未分化人 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 ES细胞(H9)和分化7天的拟胚体(7．day embryoid bodies，7-day EBs) 基因表达谱，检测到在人ES细胞分化形成的7-day EBs中约1100个基因 表达下调大于2倍及2200个基因表达上调2倍以上，并通过real-time PCR 证实了芯片结果的可靠性。在表达下调2倍及以上的基因中，包含了许多 已经证实在维持人ES细胞自我更新中发挥重要作用的基因。例如：Oet4 表达下调约14倍，Nanog表达下调约17倍，Sox2表达下调约2．6倍。目 前已初步揭示在维持人ES细胞多潜能性过程中发挥一定作用的基因也被 检测出在7-day EBs中表达显著下调。例如：TDGFl表达下调约11倍； LEFTB表达下调约42倍，DNMT3B下调约8倍等。此外，基因芯片检 测结果中包含了大量未知基因(假定蛋白和EST序列)，这些未知基因在 人ES细胞分化时表达显著改变，但它们的完整基因序列目前仍未获得。 其中两个EST序列(GenBank登录号：BF223023、BC020935)在人ES 细胞中表达水平较高，尤其是BF223023在未分化人ES细胞中表达水平 与Oct4和Nanog相似，而当人ES细胞分化形成EBs时其表达显著下调 (19．7倍)，并且在多篇文献报道的芯片结果中均有出现，提示我们该EST 所代表的基因可能与人ES细胞自我更新调控相关。 为了在高通量水平分析人ES细胞分化的早期分子事件，我们又对芯 片结果中表达下调和上调2倍及以上的基因进行了基因归类注解分析 (Gene Ontology，GO)。通过GO网站在线分析，我们得到每个基因最 具代表性的GO术语。根据基因功能分类注释研究我们也发现表达改变2 倍及以上的基因包含大量与细胞分化和胚胎发育相关的基因。由此可见， GO分类注释为我们研究与人ES细胞分化和自我更新机制以及胚胎发育 过程的分子事件提供了重要线索。 【人胚胎干细胞特异性高表达新基因的克隆和鉴定】 将BF223023作为种子序列，在人EST数据库中寻找与其匹配的序列， 之后利用手工方法将所检索到的EST重叠群拼接获得一个长度约2330bp 的序列。检索NCBI网站的人类非冗余基因数据库未发现其它基因与该序 列匹配，说明该基因是一个新基因，我们将其命名为人胚胎干细胞相关基 因(Human embryonic stem cell r