洋葱内表皮细胞架的观察.pptVIP

微管 主要成分微管蛋白 微管主要分布在核周围， 呈放射状向四周扩散 中间丝 直径介与微管与微丝之间，故得名中间丝（中间纤维 IF）? 8——10nm。中间纤维则分布在整个细胞中。 IF结构稳定：既不受秋水仙素也不受细胞松弛B素影响，并且也没有极性。 M缓冲液 M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。 Triton X-100 （聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）。分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。非离子型表面活性剂它在水溶液中不产生离子的一种表面活性剂。它在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团。 表面活性剂 表面活性剂分子结构具有两亲性： 一端为亲水基团，另一端为疏水 基团。溶解于水中以后，表面活 性剂能降低水的表面张力，并提 高有机化合物的可溶性。 考马斯亮蓝G-250 考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。 3%-戊二醛 作为一种有机交联剂 戊二醛在一定条件下能将单体、线型高分子或预聚物转变成三维网状结构的物质。 戊二醛在1%浓度时，交联度已达到很高的程度，在此浓度以下，随浓度下降，交联度下降，溶胀度和降解率增加。浓度超过1%时，各指标无明显变化。 交联剂是一种能在线型分子间起架桥作用，从而使多个线型分子相互键合交联成网状结构的物质。促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质。 LOGO 洋葱内表皮细胞骨架的观察 一、实验目的 1、掌握植物细胞骨架显示的原理及染色方法. 2、观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构 二、实验原理 细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的纤维蛋白所组成的网络结构。 ①、细胞骨架的概念 红：微丝 绿：微管 电镜下的微管 1.微管蛋白 （一）微管的化学组成 微管蛋白 ?微管蛋白 ?微管蛋白 异二聚体 2个鸟嘌呤核苷酸（GTP)结合位点。 可与秋水仙素、长春花碱结合。 ?微管蛋白 ?微管蛋白 异二聚体 聚合 首位相连 原纤维 微管 （13） 微丝的形态与组分 形态：是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细丝。直径 5-7nm，长短不一。 在细胞中，微丝可成束、成网或纤维状分散分布，主要分布与细胞质膜的内侧。 在具有运动功能的细胞中比较发达。 微丝 化学成分 肌动蛋白 肌动蛋白结合蛋白 二、实验原理 细胞骨架 细胞生长、运动 维持细胞形态 分裂、 分化 基因表达 能量转换 信息传递 物质运输 ②细胞骨架的功能 微管 微丝 中间丝 二、实验原理 ③细胞骨架组成及分类 根据组成成分及形态结构 细胞质骨架 细胞骨架 细胞膜骨架 细胞核骨架 细胞外基质 细胞质骨架 广义 狭义 二、实验原理 ④细胞骨架观察方法 电镜 组织化学 间接免疫荧光 酶标 观察方法 二、实验原理 ⑤试剂选用原因 1 Triton X-100可溶解抽提细胞中的蛋白质和脂质，但不破坏细胞骨架系统，因此显得更清晰 3 M-缓冲液洗涤细胞，可以提高骨架稳定性 2 戊二醛固定能较好保存骨架成分、考马斯亮蓝R250染色，使骨架蛋白着色，胞质背景着色弱，有利于骨架显示 注意微丝微管和中间丝都是直径很小的结构，最大的单根微管才25nm左右，只能在电镜下观察。 本实验用普通光镜是因为骨架纤维成束分布，染色后有夸大作用。由于细胞经抽提后剩下的主要是细胞骨架，使之显现更清晰。 三、实验用品 1、材料 2、器材 3、试剂 洋葱鳞茎 显微镜、小烧杯、滴管、载玻片、盖玻片、镊子 ⑴ M-缓冲液 ⑵ 6mmol/L磷酸缓冲液 ⑶ 1% Triton X-100 ⑷ 0.2%考马斯亮蓝 R250 ⑸ 3%戊二醛 ②3.0%戊二醛：用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制 ③0.2％考马斯亮蓝R250：甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46.5ml 三、实验用品 4、试剂配制 ①1% Triton X-100：一般配成30%储备液，通 常Triton X-100与M-缓冲液以所需比例混合置于30-40 ℃ 水浴2-3小时，以便液体充分混匀。使用时将30%储备液临时稀释成1%。 LOGO