转录组的研题究技术方法及当前.pptxVIP

转录组的研究技术方法及当前进展;什么是转录组？;为什么研究转录组？;研究转录组的基本方法;转录组的各个研究方法的特点;（2）SAGE法的特点;(3)MPSS法的特点;(4）高通量测序技术的特点;二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先前的基因芯片(microarrays)和基因表 达系列分析技术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全面地揭示生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达情况, 如发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单核苷酸的多态(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性变异(structural variation)。对于 序列信息有限的非模式生物, RNA-seq更偏重编码 区域。由于相比于基因组, 重复元件和高GC区比较 少, 使得拼接相对容易, 所以转录组研究在许多非模 式植物中得到了广泛应用。;(1)数字化信号：直接测定每个转录本片段序列, 单核苷酸分辨率的精确度, 可以检测单个碱基差 异、基因家族中相似基因以及可变剪接造成的不同 转录本的表达, 同时不存在传统微阵列杂交的荧 光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题, 能覆 盖信号超高的动态变化范围。(2)高灵敏度：能够检 测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。(3)任意物 种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针, 因 此无需了解物种基因信息, 能够直接对任何物种进 行转录组分析, 这对非模式生物的研究尤为重要, 例如 Wang 等、Xiang 等 和 Vera 等利用 RNA-Seq 技术分别对白粉虱、海鲈鱼和蝴蝶转录组 进行了研究。同时能够检测未知基因, 发现新的转 录本, 并精确地识别可变剪切位点及 cSNP, UTR 区域。 ;(4)更广的检测范围：高于 6 个数量级的动 态检测范围, 能够同时鉴定和定量稀有转录本和正 常转录本; 而芯片对过低或过高表达的基因缺乏敏 感性, 因而动态检测范围小。此外, RNA-Seq 重复 性好, 无需技术重复, 而且起始样品比芯片技 术要少得多, 尤其适用于来源极为有限的生物样品 分析, 如癌症干细胞。 ;测序技术 的 改进和测序费用的高； 生物信息学分析软件的开发不彻底，测序虽然得到了大量的数据, 但基于有限的生物信息学分析软件, 经常导致人们所对要分析的东西不能得到很好的结果 , 造成测序数据的浪 费 ； 平台测序长度不够大，目前虽然发展起来的 454 FLX 测序平台测序长度能达到700hp以上, 但测序费用的昂贵使得许多科研工作者望而却步;虽然 R N A 一seq 技 术还面临着种种困难, 相信随着相关学科的进一步 发展和测序成本的进一步降低, R N A 一seq 必将为基 因的研究提供强有力的手段 , 并在转录组学研究领 域占据主导地位 “也相信随着测序技术的不断进步 , 人们能够对转录组开展更为深人的测序工作, 能够 发现更多 、更可靠 、更有用的转录本 。;转录组前沿的一些研究;（2）转录组测序确定RNA结构 2010年12月份美国加州大学圣克鲁兹分校霍华德·休斯医学研究院Sofie Salama教授所领导的课题组描述了一种通过转录组高通量测序方法测定RNA结构的方法(Fragmentation sequencing ，FragSeq)，该方法发表在《自然—方法学》。该方法利用核酸酶P1只切割单链RNA的特性对小鼠RNA进行片段化，片段化RNA的大小在20–100nt之间，然后在片段的5’和3’端分别加上测序接头，再进行逆转录和PCR扩增，最后构建FragSeq文库并对其进行高通量测序。同时作者通过生物信息学分析大量的高通量测序结果，并辅以实验数据成功测定了小鼠的非编码RNA的二级结构。;（3）转录组测序在疾病方面的应用 转录组测序 (RNA-seq) 是最近发展起来的利用高通量测序技术进行转录组分析的一种技术, 可全面快速地获得特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的成熟mRNA和ncRNA。相对于传统的基因芯片技术，RNA-seq技术不需要针对已知序列设计探针，即可检测细胞或组织的整体转录水平。RNA-seq技术具有更灵敏的数字化信号更高的通量以及更广泛的检测范围。在疾病的机制研究以及疾病治疗领域，转录组测序作为一个有力的工具已经被广泛使用。;2010 年7 月, 密歇根大学Arul MChinnaiyan实验室分析了15 例前列腺癌样本的转录组测序结果, 研究发现其中有两例前列腺癌样本的ETS基因没有发生融合，进一步的研究表明存在于Raf信号途径中的BRAF和RAF1基因会发生融合现象