纤维素酶活签力测试探讨.pptx

纤维素酶活力测试探讨天然纤维素的完全降解需要多个酶组份的协同作用，因此精确测定一个酶制剂的纤维素酶活力是比较复杂的．而且在纺织印染等应用领域中纤维素高分子结构变化与一般;通用的纤维素酶活力测定中的还原糖得率反映的酶活力往往无直接相关性．这就给目前纤维素酶的生产及应用带来很多困惑。纤维素通过纤维素酶在适当的条件下催化水解后，能切断B一1，;4苷键，生成纤维二糖、寡糖，并进一步生成葡萄糖．由于它们均具有一定的还原性．在特定的条件下，可以与氧化剂DNS反应．生成有色化合物，用分光光度计测定其吸光度，确定低分子;糖的量，从而计算出酶的活 力 为了选择适宜的酶活力测定条件，提高测定结果的准确性．本文根据有关资料所采用的测定条件．选择滤纸和CMC为底物，求出还原糖的浓度，再求出酶的;活力，并对酶活力测定中的几个主要影响因素???行了研究。1 实验方法1．1 试验药品、设备纤维素酶(DH一8405，DM一8637，德美化工)，DNS试剂，冰醋酸，醋酸钠，;葡萄糖(分析纯)，滤纸(定性)，羧甲基纤维素酶CMC(试剂 级)，纯棉针织半漂布 SPECT0RPH0T0METERVIS一723型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司;)；HB一4CF型高温试色机(XIAMEN RAPID CO．，LTD)。1．2 试验方法1．2．1 酶活力测定方法本实验中酶活力的定义为1 gN体酶f或1 rnl液体;酶)，在50 度，pH=4．5条件下，1 h水解底物产生相当于1 mg葡萄糖的还原糖量为1个酶活力单位．以 u／g表示。取适当酶液．分别以滤纸或CMC溶液为底物．于50;℃ 恒温水解反应．然后加入显色剂DNS．沸水浴煮沸，加入蒸馏水，在540 nm测定吸光度值。1．2．2 纤维素酶应用工艺和效果评定纤维素酶用量为1．5 g／L，NN55;℃ ，调节pH= 4．5，浴比1：10，处理时间45 min，得出减量率。将酶处理前后的试样在105℃ 烘箱中烘至恒重。其中减量率=[处理前织物干重一处理后织物干重);／处理前织物干重]xl00％2 结果与讨论2．1 稀释倍数影响(滤纸法)DH一8405、、DM一8637稀释倍数与酶活力的关系见表1、表2。如以酶活力为y轴，以稀释倍数;为X轴作图，所得曲线的拟合一元线性回归方程为y=1．1226x+ 3422，R2=0．9890。同样好作酶活力(v)与稀释倍数(x)的关系曲线．其拟合一元线性回归方程为;v=0．5023x+853．65， R2==0982。由以上结果可知．稀释倍数的改变会明显改变酶活力测定的结果。在一定范围内稀释度大．酶活力结果偏高．稀释度小．结果偏低;．但是稀释度过大．结果也有所降 低：另外．参考各类纤维素酶活力测定方法．用不同稀释度的酶液对酶活力拟合一元线性回归方程．可看出该线性相关区域较窄．且对于不同的酶存在不同;的线性关 系．在此线性范围内．由任一稀释酶液得到的结果都可以推算得到酶液活力。当然这样给测试带来很多不便．平常测试中也可以规定吸光度的范围．如以吸光度值 0．5左右酶活;力定为100％．可看出在此值左右所测酶活力波动不大．相对较稳定。2．2 底物选择影晌滤纸作为底物结构较为松散．可及区较多．是聚合度和结晶度都居中等的纤维性材料．容易同时;被内切酶和外切酶降解．再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖，反 映的是纤维素酶三类酶组分的协同作用的总酶活：另外由于外切酶对纤维素链的专一性高，而内切酶的专一性较低．在降;解CMC时．主要反映的是内切酶的活力因此．酶对不同底物的活性是不同的．同一酶活测定方法获得的几种酶制剂的活力数值．在作用其它底物时仅能作为参考。本实验中选用了滤纸和CM;C两种底物． 对DH一8405、DM一8637NJ种酶进行活力测试，其结果如表3 由3表可知，以CMC为底物测得的酶活力值比以滤纸为底物测得的酶活值高，即两种酶的内切酶;活力较高．且比总酶活还大，几乎差一个数量级。可能是由于 CMC为水溶性底物，而滤纸与酶属多相催化，所以反应的空问阻碍较大．也说明了吸附对酶的活性部位与纤维素的结合及催化;均有很大影响。纤维素酶的3组分．每种酶对纤维素的作用部位都不同．相互之间有协同性，即使是单一的酶对不同底物的活性也是不同的．同一酶活测定方法获得的几种酶制剂的活力数值．;在作用其它底物时仅能作为参考。2.3 酶活力与减量率关系分别用DH一8405和DM一8637对白布进行食毛整理．得出平均减量率比值与酶活力之间关系．结果如表4所示。表4;可明显看出织物的减量率与内切酶活力关系密切。说明织物的酶减量率受内切酶活力影响较大。3 结论(1)以滤纸为底物．用不同稀释度的酶液对酶活力拟合一元线性回归方程．可看出两;者之间存在较窄的线性关系，在此线性范围内由任一稀释酶液得到的结果都可以推算得到酶液活力．