水稻品种dna指纹检测及其号应用2012-1.pptVIP

实验目的 学习SSR指纹图谱的构建原理与方法 应用SSR指纹图谱进行水稻品种的鉴别 实验原理 1、生物具有丰富的遗传多样性，并在个体形态上表现出千姿百态。 2、DNA分子标记技术的发展，使得在DNA分子水平揭示生物的遗传多样性成为可能。（稳定性好、不受环境和发育时期限制等多方面优越性） 3、DNA指纹图谱（条码技术）能有效鉴别不同生物物种或同一物种的不同基因型。 4、 常用的几种DNA分子标记： 1）RFLP 2）AFLP 3）RAPD 4） SSR SSR分子标记的原理： SSR序列特征： 如：————(AG)n———— 表1 不同基因型SSR指纹图谱示例 应用SSR指纹图谱鉴定杂交稻真假杂种的实例 实验材料 1、 2个杂交稻品种及其4个亲本品种 1）红莲优6号（粤泰A/扬稻6号） 2）两优培九（培矮64S/93-11） 3） P1 4） P2 5） P3 6） P4 2、 6个 SSR标记（见右表） 3、分组：1）4人一组，用2个标记分别对6个水稻品种进行PCR扩增 2）每3个小组的实验结果整合到一起，用于实验报告的撰写 实验方法 反应因子 单个反应体积（μl） 9个反应用量（μl） 1、ddH2O 10.0 90.0 2、10×buff 2.0 18.0 3、25mM MgCl2 1.8 16.2 4、10mM dNTPs 1.0 9.0 5、5uM primer 2.0 18.0 6、5 U/ul Taq 酶 0.2 1.8 (分装前先离心) 7、DNA模板 3.0 ① 94℃ 预变性 5min ② 94℃ 变性 1min ③ 55℃ 退火 1min ④ 72℃ 延伸 1min ⑤ 重复步骤② - ④ 35次 ⑥ 72℃ 延伸 10min 注：退火温度对扩增产物的影响？ 1）制胶：用1×TAE液配制4%琼脂糖凝胶70 ml+10 ul GoldViewer 2）点样：每管加入2ul溴酚兰加样缓冲液，瞬时离心。 取10ul 扩增产物点样 (请注意点样顺序) 3）电泳：稳压（100V），电泳1.5h 4）观察：紫外灯下观察电泳结果 4、实验结果分析 多态性标记的筛选 特别提示实验报告务必有图片 PCR试剂准备 1、每3个小组（12人）共用1套试剂（实际反应数36个） （PCR试剂各提供72个反应需用量，6对引物各提供12个反应需用量） 2、4个班合计173人，共提供16套PCR试剂 3、每套PCR试剂提供量（见下表） * * 水稻品种SSR指纹图谱及其应用 5）SCAR：sequence characterized amplified region 6）CAPS ：cleaved amplified polymorphic sequence 7）InDel (AG)n, n=36 (AG)n, n=112 (AG)n, n=75 SSR的 PCR扩增及电泳检测一般为共显性，在F2群体中，理论上[A]：[AB]：[B] = 1：2：1 A B AB B AB A ………… 标记等位基因的识别与标识 RM267 多态性 RM522 单态性标记 RM552 多态性 A B C A B D C A B A B M 8 B E B A M 7 B A C F M 9 B F D C M 6 C D A B E P 4 C D A B B P 3 D A A B C P2 B A B B A P 1 … M 5 M 4 M 3 M 2 M 1 标记 基 因 型 影响指纹图谱特异性的主要因素： 1、生物内在的遗传多样性 2、标记的多态性 3、标记的数目 Ref：彭锁堂、庄杰云、颜启传、郑康乐. 我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR 标记和纯度鉴定.中国水稻科学, 2003,17(1): 1～5 SSR标记RM 17 对杂交稻“两优培九”100 粒单种子的扩增结果 (M分子量Marker，A不育系，R恢复系，2轮点样） RM202 RM234 RM525 RM50