重组抗西菌肽的特性：溶解性,抗菌性,影响抗菌肽活性的因素.docxVIP

重组抗菌肽的特性：溶解性，抗菌性，影响抗菌肽活性的因素 摘要： 菌丝霉素是第一个被发现的真菌防御素，具有强的抗革兰氏阳性菌活性。为了评估菌丝霉素所潜在的治疗应用价值，本文通过生产菌丝霉素，并对其溶解性，抗菌活性及影响抗菌活性的因素进行研究。我们通过融合蛋白表达和柱上酶切，在大肠杆菌中得到高产量重组的菌丝霉素。在10%甘油的醋酸缓冲液中，加入0.5M精氨酸能显著增加菌丝霉素的溶解性，使菌丝霉素的溶解度从89ug/ml上升到408ug/ml。菌丝霉素在Tris-甘油-EDTA缓冲液的溶解度为846ug/ml。菌丝霉素具有抗革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌活性，其最小抑菌浓度分别为2ug/ml和0.5ug/ml。对革兰氏阴性菌和真菌没有抗菌活性或很低的抗菌活性。菌丝霉素（128ug/ml）对兔子红细胞没有表现出溶血活性。减少二硫酥糖醇的浓度，菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的抗菌活性会降低，表明二硫键对于抗菌肽最大活性是必须的。菌丝霉素通过生理作用和二价阳离子作用起到杀菌作用。抗菌活性会有微弱的减低在一定浓度依赖的二价阳离子下，然而，Ca离子浓度超过25mM，抑菌活性完全丧失。这些结果表明，二硫键的存在和二价阳离子的缺乏在菌丝霉素抗菌活性上扮演这一个很重要的角色。 关键词：重组 菌丝霉素 溶解度 抗菌活性 二硫键 阳离子 1 介绍 菌丝霉素，是从腐生真菌上首先分离到的类似防御素的多肽。包括一个α-β主体结构，由一个α螺旋和两个反向β股组成，通过3对二硫键来稳定结构(Cys4–Cys30, Cys15–Cys37 ，Cys19–Cys39) 。它对肺炎链球菌有强烈的机制作用，包括那些对传统抗生素有耐药性的菌株，而且在生理离子浓度下也具有杀菌作用。对由肺炎链球菌引起的胸膜炎和肺炎的实验小鼠用菌丝霉素进行治疗，其效果与万古霉素和青霉素相当。菌丝霉素对A549细胞，正常人类支气管上皮细胞，肺成纤维细胞没有毒性，不引起转录，能刺激A549细胞产生IL-8因子，所以其被认为是相对安全的。这些结果表明，真菌菌丝霉素作为临床上潜在的抗生素替代品将会做进一步的研究和关注。 菌丝霉素在中性PH条件下溶解性很差，有报道表明，像葡萄糖，精氨酸，EDTA,二甲基亚砜等小分子能有效的抑制其聚集，从而便于蛋白质的正确折叠。我们猜测这些小分子可能是影响菌丝霉素的溶解度。防御素中二硫键被保留下来，一般认为对这一类型的多肽，二硫键在维持结果稳定和生物功能上起着重要的作用。然而，在菌丝霉素中二硫键的作用并没有完全弄明白。 体外实验表明，多数防御素的抗菌能力收到阳离子的影响，特别在生理盐水存在的条件下进行评估。菌丝霉素在生理离子强度下表现出杀菌效果。但是阳离子对菌丝霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌活性的确切的影响没有见到相关报道。 我们通过大肠杆菌表达系统得到了重组的菌丝霉素，同时研究了小分子对抗菌肽溶解性的影响。我们对重组菌丝霉素的抗菌谱和溶血活性都做了描述，并对二硫桥和离子对抗菌肽的抗菌活性影响做了研究。 材料与方法 2.1菌株和质粒 E. coli DH5用来繁殖pET-32a(+)和pETplectasin 质粒, E. coli BL21(DE3)作为表达载体，抗菌活性检测的目标菌株是 E. coli CVCC 195(K88), Pseudomonas aeruginosa CVCC 2087, S. aureus ATCC 25923 and S. pneumoniae CVCC 2350 均购于中国兽医药品监察所， 重组表达和菌丝霉素纯化 成熟的菌丝霉素基因是根据大肠杆菌优势密码子通过反转录合成。由sangon生物科技公司（中国上海）合成的包含一个BamHI识别位点，一个蛋白酶因子Xa切割位点，成熟的菌丝霉素编码基因，终止密码子，Xhol位点的DNA序列。经过BamHI，Xhol消化后，将DNA序列连接到pET-32a(+)上，构建重组的PET菌丝霉素质粒载体，将PET菌丝霉素质粒转化到大肠杆菌DH5α内，然后在添加100ug/ml的氨苄青霉素LB琼脂平板上培养，通过DNA序列来鉴定质粒的正确链接和转化。 在37℃下，将重组E.coli BL21（DE3）培养在含有100ug/ml的TB培养基里，至OD600为1.0。然后通过添加0.4mM IPTG诱导菌丝霉素基因表达。在30℃下，诱导表达的时间分别为0h，1h，2h，4h，6h，16h。通过梯度离心（12,000 rpm, 5 min and 4 ?C），收集上清液，通过12%SDS进行分析。 1个湿重细胞经过5ml结合缓冲液（50mM NaH2PO4，300mM NaCl,10mM 咪唑，pH8.0）进行悬挂和细胞膜片段化处理（150W，6×5min of