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综合实验：精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 PAGE PAGE 1 精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 报告题目 藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 作者姓名 余姣 班级学号 0801/2008114010130 指导教师 汪劲松 完成时间 2011年5月 生物学实验教学中心 目 录 TOC \o 1-3 \u 摘要 PAGEREF _Toc280519524 \h 1 引言 2 1 实验材料 2 2 实验方法 3 2.1菌种活化 3 2.2扩大培养 3 2.3 IPTG诱导AK的表达 3 2.4 AK的提取及其纯化 3 2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 3 2.6 AK的检测SDS电泳 4 3 结果与分析 4 3.1 提取物的层析谱图与分析 5 3.2 提取物SDS电泳图与分析 6 总结 6 参考资料 7 综合实验：精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 PAGE 1 藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 余姣 （指导老师：汪劲松） 摘 要： 精氨酸激酶（AK)(E.C.)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱 ）纯化AK，最后SDS电泳，鉴定。 关键词：精氨酸激酶 亲和层析 光谱分析 精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化 余姣 （指导老师：汪劲松） 引言： 蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。为学习和掌握蛋白质的提取方法，对精氨酸激酶进行提取及其鉴定。无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。 1 实验材料与仪器 卡那青霉素：100mg/mL。 LB培养基：10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，加水调至1L，新配制的并 用新配制的NaCl、Hcl调节PH至7.0。分装后高压蒸汽灭菌。 IPTG诱导液：400 mg/mL。 裂解液: 主要成分为 Tris，NaCl，EDTA。 Stripping buffer：10mL EDTA，20mM Tris base, pH=8.0, 加蒸馏水调至1升。 Binding buffer: 100mM Nacl, 20mM Tris base, pH=8.0, 加蒸馏水调至1升。 含配基咪唑的洗脱液：梯度为50 mM和200mM 处理液主要成分：溴酚蓝指示剂， SDS变性剂。 考马斯亮蓝R-250染色液：50mL甲醇+10mL乙醇+40mL蒸馏水+0.25g考马斯亮蓝。 12%的分离胶5mL：Tris-cl pH8.8 1.3mL, 30%丙烯酰胺 2mL, 10%SDS 0.05mL, 10%过硫酸铵0.05mL, H2O 1.6mL, TEMED光催化剂0.002mL。(这些药品都需按顺序加入柱子中，最后加水使水与胶之间的界面保持在一条平行线上。） 12%的浓缩胶2mL：Tris-cl pH6.8 0.25mL, 30%丙烯酰胺 0.33mL, 10%SDS 0.02mL, 10%过硫酸铵0.02mL, H2O 1.4mL, TEMED光催化剂0.003mL。 分离胶 仪器：紫外分光光度计U－4300，电脑恒温层析柜、 ORION pH计、 紫外检测仪、冷冻离心机、 超声破壁仪 、雪山制冰机、 超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、 单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌锅 2 实验方法 2.1菌种活化 取100 μL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 μg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。 2.2扩大培养 将试管中活化的菌液6mL接种到100 mL LB培养基，同时加入卡那青霉素（终浓度50 μg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3 小时。 2.3 IPTG诱导AK的表达 实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入 IPTG诱导表达发