兽疫链球菌ATCC39920诱导表达系统的构建及应用-发酵工程专业论文.docxVIP

摘要透明质酸(Hyaluronic 摘要 透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种线性、大分子量粘多糖，被广泛应用于 医药、化妆品等行业。兽疫链球菌(跏印，DcDcc淞叼“f subsp．zDD印f比聊fc“s)是工业 发酵生产HA的主要菌株，研究其生物学和代谢机理具有重要意义。基因调控表达是 揭示基因功能的有效手段，对兽疫链球菌尚缺乏基因诱导表达系统，严重阻碍基因功 能的研究。本研究以兽疫链球菌ATCC39920为研究对象，报道四种基于质粒调控的 诱导表达系统：蔗糖、乳糖、木糖和乳酸链球菌素(nisin)调控的诱导表达系统；并 以编码透明质酸合成酶的办删基因作为报告基因，以办口叫基因功能缺失导致荚膜缺 陷的△向口鲋作为宿主菌，观察诱导后荚膜生成情况验证系统的可行性；依据 △办别／pLH201的特性建立可控的两步法产HA的发酵模式。主要研究结果如下： 1、构建兽疫链球菌ATCC39920稳定复制的质粒 以pSET4s质粒为出发载体，成功构建大肠杆菌．兽疫链球菌穿梭质粒pLH200， 其拥有来源于pWV0l质粒的厂P础基因和用于筛选的壮观霉素抗性标记。包含pLH200 质粒的兽疫链球菌在无抗生素压力条件下培养24 h，pLH200质粒丢失率为O％，表明 此质粒用于基础研究的同时可避免使用抗生素引起的耐药性变异。 2、构建并分析四种诱导表达系统 以pLH200质粒为出发载体，插入sc旭．P刚调控元件，构建蔗糖诱导表达质粒， 在P。洲下游插入报告基因力嬲4，构建蔗糖调控向傩彳表达质粒pLH200：：scrR．P卵叫：：办傩彳‘ (pLH201)。分别用，口积-P托小砂腿-％朋和，?括肛，2括R．^蒯调控元件替换sc厂尺一B洲构建 乳糖、木糖、nisin调控的诱导表达质粒。四种诱导系统可行性分析表明：乳糖系统诱 导表达效率低；木糖和nisin系统不能诱导基因表达；蔗糖系统可严谨且高效诱导基 因表达，此诱导系统的成功构建为开展兽疫链球菌基因功能的研究夯实了基础。 3、建立可控的两步法产HA的发酵模式 将pLH201质粒电转化入幽州菌株中，构建幽州／pLH201菌株。此菌株在以葡 萄糖为糖源的培养基中不能合成荚膜，解除高粘度发酵液对溶氧和基质传递的限制； 其在蔗糖诱导下恢复合成荚膜的能力。据此本论文提出可控的两步发酵模式：在0．12 h添加初始浓度为30∥L的葡萄糖，意在获得高密度菌体。在12．24 h添加初始浓度 为20∥L的蔗糖，意在诱导合成荚膜，收获HA。经两步发酵后，△力剁／pLH20l的 HA产量为3．4∥L，而△办口鲥几乎检测不到HA。△办口叫／pLH201生物量为2．7∥L，期 望通过深入研究提高其菌体密度，利用此发酵模式必将提高HA产量。 关键词：兽疫链球菌；诱导表达系统：可控调节；两步法发酵；透明质酸 万方数据 ABSTRACTHyaluronic ABSTRACT Hyaluronic acid(HA)is lineaL high m01ecular weight polysaccharide and has been widely applied in medicine，cosmetics a11d otller industries．坨pfDcDcc姗zDDP矽f如聊纪”s is used for microbial production of hyaluronan on an industrial scaJe．Intensive research on S zDD9pf如，卯fc“s bi0109y and met￡山01ism mechanism is of great significance．Ideal inducible promoter system is an e丘’ectiVe way to study gene function．However，the lack of a11 e虢ctiVe inducible promoter system for S zoo印f沈m记淞 has notably prevented t11e functional genomics a11alysis of this gram—positive bacterium．In this study，即fDcDcc“s Pg甜f subsp．zoo印耐量历耙螂ATCC39920、vas used as the object of study．Here，we repoIrt the deVelopment of four plasmid-baSed inducible promoter systems，that is，sucrose，1actose， xylose and nisin con