聚合酶链式反应-本科PCR.pptVIP

聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction，PCR） 质粒——染色体外能够进行自主复制的遗传单位，现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。 聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。 可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)：体外核酸扩增系统，是一个在模板DNA、引物（模板片段两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，依赖于DNA聚合酶的DNA片段合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。 基本原理：核酸分子杂交 特点：特异性、高效性、忠实性 PCR基本原理示意图 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 核酸琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（EB）。在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况。（注：EB为强烈致癌物）。 不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围 琼脂糖浓度(%) 分离DNA片段的有效范围(kb) 0.5 1-30 0.7 0.8-12 1.0 0.5-10 1.2 0.4-7 1.5 0.2-3 PCR反应 反应体系： 在0.2ml薄壁离心管中依次加入： PCR体系预混液： 12.5μl 上下游引物： 1 μl ddH2O： 9.5 μl （最后加）DNA模板： 2 μl （总25 μl ） PCR体系预混液中包含Tris-Cl、KCl、MgCl2、Taq DNA polymerase、4种dNTPs 反应条件： 94 ℃ 4 min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 72 ℃ 30s 72 ℃ 4 min hold 4℃ enter 扩增产物片段长度为290bp 琼脂糖凝胶电泳 1.纯化的质粒DNA电泳： DNA溶液48μl + 6μlLoading buffer→取20μl上样 2.PCR产物电泳： 25μl反应体系 + 3μl Loading buffer→ 取10 μl上样 琼脂糖浓度为0.7% ，电压80V，电泳20-45 min，紫外灯下观察并拍照保存实验结果。 思考题 PCR技术应用的衍生及进展。 质粒提取预期实验结果 PCR预期实验结果 * 待扩增目的DNA片段（红色区域） 氢键 3’ 5’ 3’ 加热变性后氢键被破坏，模板分成两条单链。 5’ 5’ 3’ 3’ 加热变性 5’ 3’ 3’ 退火 （迅速降温） 退火后，由于引物分子小，浓度又高，在模板之间 还未复性前就迅速与模板匹配结合。 5’ 3’ 3’ 引物2 引物1 引物是人工设计并合成 的脱氧核苷酸短链。 升温至Taq酶最适温度 在Taq酶最适温度下，新链合成，不断延伸；在终止 延伸时，新链的长度可能长于目的片段，延伸至目的 片段外侧区域。 5’ 3’ 3’ 引物2 引物1 3’ 3’ 5’ 5’ 新链延伸方向 总是从5’ → 3’ 变性温度下链间氢键又被破坏，双链分开成单链。 5’ 3’ 3’ 再次升温至变性温度 5’ 5’ 3’ 3’ 退火后，引物又与模板匹配结合。 5’ 3’ 3’ 退火 （迅速降温） 5’ 5’ 3’ 3’ 引物1 引物1 引物2 引物2 注意引物与模 板匹配的位