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（四）探针的标记 probe labeling 1．均一标记 切口平移nick traslation: E.coli DNA polyI 随机引物 random primer: 6Nt or 6～12nt klenow 2．单链探针 ssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探针 RNA探针，RNA polymerase 3．末端标记 Klenow 标记3’端, 补平和置换反应 T4 polymerase 标记3’端 3’-5’外物活性强，特别适用于3’突出末端 Kinase 标记5’端 正反应 32P→5’-OH NNNN→5’pNNNN 交换反应 过量ATP 使5’-P→ADP then 32P→5’ 末端转移酶标记3’ 4．寡核苷酸 Kinase 末端转移酶 5．标记物 放射性: 32P，33P，35S 非放射性: DIGoxigenin Biotin 标记 dUTP (五) DIG标记/检测举例 1.探针标记 6 Nt随机寡核序列苷酸引物, Klenow标记 2．检测 漂洗 blocking 免疫反应 labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗涤 显色反应 化学发光检测 NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀 * 第四章 大分子的分离和分析 一、E.coli质粒DNA的分离和纯化 1．质粒DNA的小量提取 第一节 DNA的分离、检测和纯化 1．质粒DNA的小量提取 ① 步骤性原理 在碱性条件下，线状DNA变性，质粒DNA维持环状，高盐条件下复性，除质粒DNA外，形成沉淀。 ② 步骤 细菌培养物的生长、时间、量 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化（苯酚/氯仿 梯度离心） Sol I Tris-HCl, EDTA, Glucose Sol II NaOH-SDS Sol III 3M KAc DNA purification Kit (QiaGen) 二、DNA的电泳检测 主要检测：分子量，含量及有无 1. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖 从海藻中提取的一种线状高聚物 常规熔点 低熔点 Gelling point 25℃ 20-30℃ Melting point ?65℃ 电压 迁移率与电压成正比 ?2kb 应 ? 5 U/cm 电场方向 单一方向 负 →正 脉冲电场 几百kb以上 温度 4℃-30℃， 0.5% or 低熔点 4℃ buffer TAE TBE TPE 50mM (pH7.5～8.0) ．碱性agarose电泳 用于分析 ssDNA/Southern 杂交 londing buff 溴酚蓝/二甲苯菁FF 40% Sucrose 染色/摄影 EBt 0.5?g/ml 10mg/ml store (棕色瓶or铅铂纸) UV 波长：长366nm, 短254, 一般302 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 优点: 分离率高 1 bp, 点样量高 10?g 回收的DNA纯度高 非变性: 迁移率与序列和组成有关 变性(尿素/甲醛): 无关，分离探针，S1酸产物分析，DNA测序 三、DNA片段的纯化（从agarose） 1.低熔点agarose电泳 gel + 5vol tris 65℃ 5min phenol extract ethanol 2.透析袋，电洗脱法 可用于?5kb 3.Glass Milk (bead) 3M NaI 溶液，bead吸附 洗涤 elute 4.Kit Qiagen 公司 一个典型哺乳动物细胞约含 10-5?g RNA，其中80-85%为rRNA(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三种类型)，其余15～20%主要由各种类型的低分子量RNA组成（如tRNA，核内小分子RNA等）。 mRNA为总RNA的1～5%，3‘端有一个poly(A)尾，可与oligo(dT)-纤维素，吸附，亲和层析分离寡脱氧胸苷酸。 第二节 RNA的分离、纯化和检测 一、注意事项控制RNA酶的活性 (一) 实验用具和溶液的去RNA酶处理 1. 玻璃制品、塑料制品、电泳槽 一次性使用用品/第一次使用的用具，可稍作处理 器皿：180℃ 8hr or longer， 氯仿冲