荧光免疫特技7年制.ppt

目的与要求 1.掌握荧光免疫技术的原理 2.掌握荧光抗体技术(荧光抗体的制备、免疫荧 光显微技术及在医学检验中的应用) 3.熟悉有关荧光的基本知识 4.熟悉荧光免疫技术的应用 二、有关概念 １、激发光与发射光 激发光：物质分子成为激发态时所吸收的光 发射光：处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光 2、发射光谱与激发光谱 发射光谱fluorescence spectrum：固定激发光波长, 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线 激发光谱 excitation spectrum ：固定测量波长,化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线 　 　 激发光 400nm 任何发荧光的物质分子都具有两个特征光谱--激发光谱和荧光发射光谱 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大 3.激发光谱与发射光谱的关系 　　２、荧光素要求 ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 荧光素-N=C +NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质 ‖ ︱ ︱‖ ︱ S H H S H ⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显。 ⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 ⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性 ⑸ 标记方法简单、快速。 ⑹ 安全无毒 (3) 标记抗体的纯化 1）? 去除游离的荧光素 ①透析法： ②凝胶过滤： 凝胶过滤 2）? 去除过度标记的蛋白质分子： ? 离子交换层析： DEAE—纤维素过柱法 (4)荧光抗体的鉴定 1）F/P比值鉴定? F/P比值：荧光色素与球蛋白的结合率 测定方法：将制备的荧光抗体稀释至 A280≈1.0，分别测读A280（蛋白 质特异吸收峰）和 标记荧光素的特 异吸收峰 2)荧光抗体纯度的测定：免疫电泳测定 3) 荧光抗体效价的测定 4）荧光抗体的特异性试验 二、免疫荧光显微技术 1、基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，借助荧光显微镜观察底物片上特异荧光染色反应，来判断有无待检抗原或抗体。 immunofluorescence microscopy, a linear pattern of IgG, and C3 (complement protein) along the basement membrane （3）双重染色法 　应用： 在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如A抗原和B抗原）， A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗丹明标记 染色方法： 　　1．一步法双染色　 先将两种标记抗体按适当比例混合 （A+B），按直接法进行染色 　　2．二步法双染色 先用RB200标记的B抗体染色，不必 洗去，再用FITC标记的A抗体染色 　结果： A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光 5、结果判定 （-）： 无荧光 （+/-）：极弱的可疑荧光 （+）： 荧光较弱 （++）：荧光明亮 （+++~++++）：荧光闪亮 Confocal image showing a macrophage in the lung of a mouse infected with SARS-corona virus. Double immunofluorescence labels the macrophage in red with antibodies against Mac-2 and viral protein in green with antibodies against spike. 谢 谢 组织、细胞、细菌 涂片、印片、组织切片 　 固定 染色 荧光显微镜检查 标本 2、程序 3、实验类型及原理： 　　间接法 　　直接法 　　补体结合法 　　双标记法 抗原 标记抗体 光源 荧光 直接法原理示意图 （1）直接法 直接