游泳池水中大肠菌群检验方法.doc

游泳池水中大肠菌群检验方法 ?一、大肠菌群多管发酵法测定1定义大肠菌群（coliform?bacteria）系指一群在36±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。2?仪器见《公共场茶具的大肠菌群测定方法》。3培养基和试剂3.1乳糖蛋白胨培养液3.1.1成分：蛋白胨?10g牛肉膏?2g乳糖?5g氯化钠?5g1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液?1mL蒸馏水?1000mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。3.1.2配法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH到]7.2～7.4。再加入1ml?1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有倒管的试管中，115℃高压灭菌15min。3.2伊红美兰琼脂见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。3.3革兰氏染色液风《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。3.4染色法见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。4推测性试验4.1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10ml。4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。5证实试验5.1平板分离自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。5.2复发酵试验挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。5.3凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的最大可能数（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。　 总大肠菌群（MPN）检索表100mL水量的阳性管数?100mL水量的阳性管（瓶）数?0?1?2?每L水样中总大肠菌群?每L水样中总大肠菌群数?每L水样中总大肠菌群数? ? 二、大肠菌群滤膜法测定1?定义????????大肠菌群（coliform?bacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。2仪器2.1滤器2.2滤膜:乳径0.45m?m。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。2.3抽滤设备2.4无齿镊子2.5其它仪器见《公共场所茶具的大肠菌群检验方法》3培养基3.1品红亚硫酸钠培养基3.1.1成分：蛋白胨?10g酵母浸膏?5g牛肉膏?5g乳糖?10g琼脂?10～20g磷酸氢二钾?3.5g无水亚硫酸钠?5g5%碱性品红乙醇溶液?20mL蒸馏水?1000mL3.1.2储备培养基的制备将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900ml蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值到7.2～7.4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000ml，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，?115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。3.1.3平皿培养基的制备将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品戏乙醇溶液与培养基按1：50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。再按1：200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个来菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌10min。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内，?待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。3.2乳糖蛋白胨培养液见《游泳池水中大肠菌群多管发酵测定法》4操作步骤4.1滤膜灭菌：将滤膜放入含蒸馏水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮混后需更换水洗涤2～3次，以除去留溶剂。4.2滤器灭菌：用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。4.3水样过滤：用无菌镊子夹灭菌滤膜边缘部分，将滤膜粗糙面向上，贴放在滤床上。固定好滤器，将100ml水注入滤器中,打开滤器阀门。在-0.5大气压下抽滤。4.4培养：水样滤室外后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。用灭菌镊子夹滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。然后