基质细胞衍生因子促进脂肪干细胞向创伤区域定向迁移的研究-外科学（整形外科）专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 博士学位论文(ADSCs) 博士学位论文 (ADSCs)迁移调控方面的研究尚不成熟。近年来有研究者发现，肝损伤可造 成局部肝损伤区域SDF一1的表达升高，通过静脉移植的ADSCs可募集在局部 肝损伤区域，证明通过血管移植的全身途径是行之有效的干细胞移植方法，且 ADSCs向局部损伤部位的迁移可能与SDF一1的调控有关。 目的意义 本研究的目的在于探究SDF一1对于诱导ADSCs向创伤组织定向趋化迁移 的作用，进一步验证通过调控SDF．1的局部浓度控制ADSCs向创伤组织的趋 化迁移是否可行，为充分动员ADSCs发挥促修复作用寻找新策略，对于干细 胞疗法的广泛应用也具有重要的临床指导意义。 方法 1．采用改良的酶消化法分离获得SD大鼠ADSCs，经体外培养、传代扩增细 胞，倒置显微镜下观察细胞的形态学特征，通过流式细胞检测细胞表面CD29、 CD34、CD45及CD90的表达，体外诱导细胞成脂成骨分化检测其参：向分化能 力。 2．构建携带eGFP基因的慢病毒载体，以经验感染复数MOI=40转染第3代 ADSCs，并且分别于转染后的24h、48h、72h、96h时，于荧光显微镜下观察 ADSCs的绿色荧光蛋白的阳性表达情况，并于转染一周后，使用流式细胞检测 ADSCs的eGFP阳性表达率。继续传代转染后的细胞至第九代，于荧光显微镜 下观察，验证随着细胞的增殖传代，eGFP是否可以稳定表达。用MTT法检测 Lentivirus—eGFP转染后ADSCs的细胞活性。对eGFP．ADSCs进行成脂成骨诱 导分化，以检测转染后的细胞是否仍具备多向分化能力，且验证分化后的 eGFP．ADSCs是否仍可表达绿色荧光蛋白(eGFP)。 3．利用含有SDF一1的基础培养基对体外传代至第3代的ADSCs进行培养2 天后，流式细胞技术及蛋白质印迹分析法检测其细胞中SDF一1受体CXCR4及 CXCR7的表达情况，并与正常传代培养的第3代ADSCs进行比较。 4．构建Transwell细胞迁移模型，检测体外SDF．1对ADSCs迁移的影响，并 且设置SDF一1的浓度梯度为0ug／L、lug／L、10ug／L、100ug／L，检测1—100ug／L III 万方数据 摘要浓度范围内， 摘要 浓度范围内， ADSCs的迁移与SDF．1，浓度有无相关性。 5．构建大鼠背部创伤模型，通过动脉移植途径向动物模型中注入 eGFP-ADSCs，设置空白对照组(未做创伤处理，仅移植eGFP—ADSCs)、创伤 组(大鼠背部创伤+eGFP．ADSCs移植)、SDF一1干预组(大鼠背部创伤 +eGFP．ADSCs移植+局部SDF．1给药)。定期取大鼠背部创伤组织，利用Elisa 法检测创伤组织中SDF．1在创面愈合过程中的表达趋势；利用RT-PCR检测创 伤组织中eGFP基因的表达情况，并在共聚焦显微镜下观察eGFP．ADSCs在创 伤组织冰冻切片中的迁移分布情况。定期采集大鼠循环血，利用流式细胞计数 及RT-PCR法，对eGFP-ADSCs动员入循环血的情况加以分析。并于细胞移植 后的21d，分别取三组大鼠血供丰富、氧分压较高的实质性器官——肺组织， 进行冰冻切片，于共聚焦纤维镜下观察eGFP。ADSCs在肺部组织中的分布，利 用RT-PCR检测肺组织中eGFP基因的表达情况。 6．实验过程中，分别于创伤后1d、3d、7d、14d、21d，观察记录两组创伤大 鼠创面愈合的情况，计算创面愈合率；并于创伤后7d采集两组大鼠创面组织进 行CD31免疫组化染色，比较两组创面组织中毛细血管密度。 结果 1．倒置显微镜下观察，分离培养的大鼠ADSCs呈梭型或多角形，流式细胞技术 检测ADSCs表面高表达间充质干细胞的表面标志物CD29、CD90；基本不表 达造血及内皮细胞表面标志物标记物CD34、CD45。体外成脂诱导培养14d后， 油红O染色阳性，证明其具有成脂分化能力；体外成骨诱导培养28d后，茜素 红染色阳性，证明其具有成骨分化的能力。 2．Lentivirus．eGFP转染第3代ADSCs，96h时，细胞的绿色荧光表达程度达到 高峰，此后维持在较高水平稳定表达。连续传代培养至第9代，细胞绿色荧光 表达情况仍无明显变化。转染一周后，经流式细胞仪检测，Lentivirus—eGFP转 染后ADSCs的eGFP阳性表达率为81．92％(图2．4)，可满足本实验的需求。MTT 检测结果显示Lentivirus．eGFP转染后的ADSCs与未转染的ADSCs在细胞活性 方面差异无统计学意义。对eGFP-ADSCs进行多向分化能力检测，体外成脂诱 IV 万方数据 博士学位论文导培养 博士学位论文 导培养14d后，油红O染色阳性，体外成骨诱导培养28d后