活性蛋白质千的分离与应用.ppt

活性蛋白质的分离与应用 主讲：陈安珣 概述 蛋白质是一类由多种氨基酸结合而成的长链含氮有机高分子化合物，是生物体细胞的重要组成物质之一，是生命活动的基础。 活性蛋白质是一类具有特殊生理活性的蛋白质。 概述 活性蛋白质的存在范围： 活性蛋白质广泛分布于各种生物体组织，如动植物组织、动物乳汁、植物种子等中。 蛋白质的分类 活性蛋白质的种类非常多，一般根据来源与特性可分为：活性多肽、活性乳蛋白、天花粉蛋白、谷物蛋白、豆类蛋白、花生蛋白等。 蛋白质又可以根据蛋白质分子的化学组成和结构复杂程度分类，将其分为单纯蛋白质和结合蛋白质。单纯蛋白质是指结构比较简单，在组成上基本是单纯由氨基酸构成的那些蛋白质。结合蛋白质是指结构比较复杂，由氨基酸和其他成分组成的那些蛋白质。单纯蛋白质又可以根据溶解度细分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白、硬蛋白、组蛋白、精蛋白、醇溶谷蛋白等。 活性蛋白质的性质 活性蛋白质是蛋白质中一类具有生物活性的蛋白质，像蛋白质一样，也是一类由多种氨基酸结合而成的长链高分子化合物，它具有所有蛋白质的一般性质，包括： 两性解离 等电点 胶体性质 变性 沉淀 显色反应 活性蛋白质的性质 1.两性解离： 蛋白质分子中含有多个可解离的酸性或碱性基团（酸性基团主要是C末端羧基及酸性氨基酸侧链的羧基，碱性基团有N末端的氨基及碱性氨基酸侧链的氨基、胍基及咪基）。可进行酸性解离或碱性解离，所以说它具有两性解离的特性。 活性蛋白质的性质 2.蛋白质的等电点： 在一定的介质中，某一蛋白质解离成阴、阳离子的趋势相等，成为两性离子（净电荷为零），此时介质的pH值为蛋白质的等电点。不同的蛋白质所含酸性或碱性氨基酸的比例不同，等电点也不相同。根据蛋白质等电点的不同可以通过电泳进行分离蛋白质。 活性蛋白质的性质 3.蛋白质的胶体性质： 蛋白质属亲水胶体分子，如球状蛋白质相对分子质量在6000~100万之间，直径在胶体颗粒的范围（1~100nm），且球蛋白质溶于水，分子中的亲水氨基酸残基多位于颗粒表面，在水溶液中能与水起水合作用。所以蛋白质具有胶体性质，如丁达尔现象、布朗运动、不能透过半透膜等。 活性蛋白质的性质 4.蛋白质的变性： 蛋白质在某些理化因素作用下，特定的空间结构被破坏而导致其原有的理化性质改变及生物活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。 变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。 活性蛋白质的性质 5.蛋白质的沉淀： 蛋白质沉淀是指蛋白质分子聚集，从溶液中析出的现象。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 5.蛋白质的沉淀： 可逆沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 5.蛋白质的沉淀： 不可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 活性蛋白质的性质 6.蛋白质的显色反应： 常用的显色反应有以下几种。 （1）双缩脲反应 该反应知肽键常用的反应，即在碱性铜溶液中，肽键与铜离子行程络合物，呈紫色（在540nm有最大光吸收峰）。 （2）酚试剂法 该反应是比色法测定蛋白质的常用方法，即蛋白质以碱性铜溶液处理后，加用酚试剂，呈蓝色（在650nm有最大光吸收峰）。 （3）考马斯亮蓝法 即蛋白质与一种蛋白质染料考马斯亮蓝G250反应形成复合物，该复合物在595nm有最大光吸收峰。显色反应可用于蛋白质的检测分析。 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质在组织或细胞中都是以复杂的混合物形式存在的，每种类型的细胞都含有上千种不同类型的蛋白质。分离纯化的目的就是要从复杂的混合物中将所需要的某种蛋白质提取出来，并达到一定的纯度。因纯度是相对的，因此提纯的目标是尽量提高蛋白质的纯度或比活性（即增加单位重量中所需蛋白质的含量或生物活性），设法除去变性的和不需要的蛋白，并尽可能提高蛋白质的产量。 分离提纯某一特定的蛋白质，首先要使蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原有的天然状态（不失去生物活性）。为此，动物组织的细胞膜可用电动捣碎机或匀浆器破碎，细