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分子生物学实验 重组DNA技术 质粒DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳 复 制 翻 译 转 录 不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。 不同来源的DNA分子 重组DNA分子 重组DNA技术 基本过程 载体 携带目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 作用： 1、携带目的基因进入受体细胞 2、使外源DNA在宿主细胞复制扩增或表达。 载体的特点 1. 对受体细胞无害，不影响受体细胞正常生命活动 2. 具有自主复制能力 3. 含有多克隆酶切位点 4. 携带标记基因、便于筛选 5. 除保留必要序列外，载体应尽可能小 6. 生物安全性好 载体的类型 质粒 噬菌体 病毒 质粒 存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。 第一次实验 第二次实验 第三次实验 选 切、连 转筛 质粒DNA的提取 方法： 碱裂解法 原理： 质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异 将菌液转移至1.5ml离心管中(尽量倒满) ↓ 12000rpm /30s（重复一次） 弃上清扣干，加入SolutionⅠ 100μL, 剧烈振荡打散菌体，室温3min ↓（以下操作要轻柔） 加入新配制的SolutionⅡ 200μL, 温和颠倒离心管4～5次混匀，室温放置3min ↓（此时出现拉丝现象） 加入预冷的SolutionⅢ 150μL, 温和颠倒离心管2～3次混匀，室温3min ↓离心12000rpm/5min 具体步骤 质粒DNA的上清400 μ L移至另一离心管中 ↓ 加等体积氯仿,轻微振荡 ↓离心12000rpm /2min 转移上清液350 μ L至另一离心管 ↓ 加入2倍体积无水乙醇,轻轻混匀室温放置2min ↓离心12000rpm /5min 弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀 ↓ 离心12000rpm /2min（重复一次） 弃上清，液体尽量倒净并在吸水纸上扣干 ↓室温放置15min干燥 加入TER 40μL 溶解质粒 具体步骤 Solution I 1、蔗糖：增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。 2、Tris-Cl：使溶液维持最适pH范围。 3、EDTA：螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，抑制DNA酶活性，防止其对DNA分子的降解作用。 蔗糖 + Tris + EDTA Solution II 1. SDS ：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性 2. NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性 SDS + NaOH Solution III 1. 中和溶液II的碱性，使DNA复性。 2. K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。 KAc 与HAc 质粒的鉴定——琼脂糖凝胶电泳 电泳：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。 作用：用于生物物质的分离分析 用于分析物质的纯度和分子量的测定等 电泳基本原理 当粒子稳定运动时：F’=F 即 EQ= 6πrηυ υ/E表示电泳迁移率，即单位电场强度粒子的运动速度，以μ表示： μ = υ/E = Q/ 6πrη 影响电泳的因素 溶液的pH值 电场强度 缓冲液的离子强度 电渗作用 琼脂糖凝胶分离范围 凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp） 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 实验流程 注意事项 1、制胶槽一定要放平 2、倒胶时要慢，防止产生气泡 1、与上样缓冲液、染液混匀 2、避免产生气泡 3、小心防止戳破凝胶 1