一氧化氮调控小鼠卵母细胞官成熟的信号转导机制的分析.docx

捅璺摘要 捅璺 摘要 哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟的调控是动物生殖的关键环节之一．受包括促性腺激素在内 的多种信号分子的调节。一氧化氮(N0)是一种广泛参与机体生理调节过程的重要信号分子。目 前有关NO对哺乳动物卵母细胞成熟影响的研究较少且相互有冲突。本论文采用小鼠超排卵母细 胞、体外自发成熟、促性腺激素(FSH)诱导成熟或卵泡卵母细胞成熟四种模型，系统地研究了 NO对小鼠卵母细胞体内、外成熟的影响并探讨了其作用机制。研究结果表明： 腹腔注射一氧化氨合酶(NOS)非选择性抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)对体内 小鼠卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)投有影响，但能剂量依赖性地抑制卵母细胞第一极体(PBl) 的排山，此抑制可被同时注射的一定剂量的NO合成底物左旋精氨酸(L．arg)和NO供体硝普钠 (SNP)逆转。结果提示，NO能促进小鼠卵母细胞的体内成熟。 无论是用PMSG处理过的卵丘卵母细胞复合体(CEO)还是裸卵(DO)都能够在体外自发 成熟。诱导型NOS(iNOS)的选择性抑制剂氨基胍(AG)对小鼠卵母细胞的自发成熟没有影响， 而非选择性抑制剂L．NAME和左旋硝基精氨酸(L-NNA)，虽都不影响(CEO)的GVBD以及DO的 自发成熟，但能剂量依赖性地抑制小鼠CEOPBl的排出，此抑制可被同时加入的SNP逆转。高 浓度的SNP能显著延迟CEO的GVBD发生和PBI的排出．此延迟或抑制可被鸟苷酸环化酶(GC) 的抑制剂lH一[1，2，4]二唑【4，3一a】喹喔啉一卜酮(0DO)和亚甲基兰(MB)以及蛋白激酶C的抑 制剂sphingosine逆转；最适浓度的SNP对CEO自发成熟的影响和腺苷酸环化酶(Ac)的激动 剂毛喉素(forskolin)以及cAMP依赖型磷酸二酯酶(PDE)4选择性抑制剂rolipram的作用规律 十分相似；且与蛋白激酶C的激动剂佛波脂(PMA)有协同效应。结果提示，卵丘细胞产生的 NO能依赖其浓度双重调节小鼠卵母细胞的自发成熟，且有可能是通过激活sGC进而升高cGMP 或／和cAMP以及激活PKC来实现的。 4mM次黄嘌呤(HX)能极其显著地阻滞小鼠卵母细胞的自发成熟，其对CEO的阻滞可被 低浓度的SNP、一定浓度的PMA和sphingosine逆转。PMA与SNP联合使用时，SNP对CEOPBl 释放的诱导效应被显著抑制，而GVBD不受影响。而sphingosine与SNP联合使用时，无论是对 SNP诱导的GVBD还是PBl都没有影响。SNP对CEO的促进作用不能被GC抑制剂ODQ和 MB逆转，但能被AC的激动剂forskolin和cAMP依赖型PDE4抑制剂rolipram逆转。结果提示， 低浓度的外源性NO能显著促进HX阻滞的CEO的成熟，此促进有可能依赖于卵丘细胞中的 cAMP的动态变化。 一定剂量的FSH能诱导Hx阻滞的CEO的成熟．此促进可被NOS抑制荆L-NAME和AG 剂量依赖性地抑制，而SNP和FSH在Hx阻滞的成熟中没有协同效应。SNP单独处理能使卵丘 细胞离散，和FSH联台使用能显著抑制FSH对卵丘的扩展作用。cGMP类似物8-Br-cGMP能显 著抑制FSH的促卵母细胞成熟效应。结果提示，NO／cGMP参与体外促性腺激素诱导小鼠卵母 细胞的成熟过程。 中国农业大学博士学位讫文将来用PMSG处理的，直径在250--350 中国农业大学博士学位讫文 将来用PMSG处理的，直径在250--350 u m范围内的透亮卵泡培养在MEM培养基中，卵 泡中的卵母细胞不能自发成熟。而FSH却能显著促进此类卵泡卵母细胞的成熟。NOS抑制剂 L-NAME和AG均不能显著影响卵泡卵母细胞的成熟，而SNP单独处理能显著促进卵泡卵母细 胞的成熟，和FSH联合使用却能显著抑制FSH对小鼠卵泡卵母细胞成熟的促进效应。此外， 8-Br-cGMP也能显著抑制FSH对卵泡卵母细胞成熟的促进效应。结果提示，NOIcGMP通路也参 与来用PMSG诱导卵泡同步发育的FSH对卵泡卵母细胞成熟的促进过程。 一定浓度的PDE4选择性抑制剂rolipram对CEO的自发成熟没有影响，但能促进卵泡卵母细 胞的成熟；PDE3选择性抑制剂cilstomide和PDE5选择性抑制剂zaprinast均能剂量依赖性地显著 抑制小鼠卵母细胞的自发成熟，其中PDE5抑制剂对卵母细胞自发成熟的抑制作用能被GC的抑 制剂ODQ和NOS抑制剂L—NAME逆转，但对FSH促卵母细胞成熟的抑制效应却只能被ODQ 逆转，而不能被L-NAME逆转。结果提示，PDE在卵泡卵母细胞和卵泡细胞中的分室化表达和 调控，分别调节两室中的cAMP和／或cGMP的动态变化而参与调节小鼠卵母细胞减数分裂的阻 滞和恢复过程。 总上所说，我们的研究结果可以清楚地