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抗菌肽基因工程表达技术研究进展 姓名：刘 允 攀 专业： 生物工程 抗菌肽简介 抗菌肽是有机生物体用来抵御外来病原体入侵而产生的具有抗菌作用的一类小分子蛋白质,是很多种生物先天性非特异性防御系统的重要组分。 自20世纪70年代瑞典科学家Boman等从蚕蛹中分离得到第一个抗菌肽——天蚕素(cecropin)以来。人们陆续又在昆虫、两栖类、水生动物、及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了1700余种抗菌肽。 多数抗菌肽具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫和抗肿瘤功能及独特的作用机理,尤其对耐药菌株有明显的杀灭作用,且不破坏生物体细胞、无免疫原性。众多研究结果表明,抗菌肽极有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源,具有广阔的应用前景。 1　抗菌肽的分类及来源 抗菌肽的来源 但是因为抗菌肽为生物体内诱导产生,含量较低,从生物体内直接提取难度大、效率低、对技术和成本的要求高,难以规模化生产,并且对于某些高等生物或人类抗菌肽生产而言也不现实。随着多肽及蛋白质化学结构的进一步阐明和多肽合成技术的产生,人工合成具有生物活性的肽或肽段为抗菌肽的研究提供了很大方便。 诸多研究结果表明,由于抗菌肽分子较小,化学合成的抗菌肽表现出与天然抗菌肽一致的生物学活性,但化学合成的方法同样存在成本较高的问题,限制了抗菌肽的推广应用。现代基因工程技术的发展使借助基因工程技术大规模制备抗菌肽成为可能。 2　抗菌肽的基因工程表达 2.1　大肠杆菌表达体系 由于大肠杆菌系统对许多蛋白质有较强的耐受能力,能较高水平地表达多种蛋白质使之成为表达许多外源蛋白质的首选表达系统,所以大肠杆菌是应用于DNA重组技术的主要宿主细菌,在抗菌肽的表达研究中也得到了充分的应用。 Peng等将人β-防御素2(hBD2)的基因插入到pET-32a(+)中构建融合表达载体,以E. coli BL21为工程菌进行表达,纯化后的蛋白质具有抗菌活性,该研究结果表明,应用基因工程技术可以大规模制备抗菌肽。Rao等(2005)采用串联表达的方式在大肠杆菌中表达hPAB-β取得成功,在1~8个不同重复序列的串联表达体系中,3个重复序列时蛋白质产量最高,达到菌体总蛋白的27.8%,相当于(3.15±0.45) g/L湿菌。 包涵体可完全溶于8 mol/L的尿素,三聚体形式的hPAB-β可用Ni-NTA亲和色谱分离,再用羟胺水解成独立的短肽。孙琦等(2008)成功构建了串联表达rAlloferon-1的原核表达系统,并在E.coli BL21DE3中成功表达,其表达产物具有与合成的Alloferon-1和Alloferon-1-EK相似的体外抗肿瘤细胞活性。 韩宗玺等(2008)采用GST基因融合表达系统在E. coliBL21中重组表达鸡的Gal-9抗菌肽基因,获得了理想的表达效果,诱导蛋白表达量占细胞总蛋白的40%,并且大部分以包涵体的形式存在。纯化后,检测其抗菌活性与提取抗菌肽相似,说明有些抗菌肽在进行融合表达时,不影响抗菌肽的抗菌活性。 谢芳等(2009)为了验证重组抗菌肽Ranalexin的抑菌活性,提取牛蛙皮肤组织总RNA,经RT-PCR扩增抗菌肽基因Ranalexin,克隆测序后,将该基因插入pGEX-3X融合表达载体,进行原核表达,表达产物经复性纯化后对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌活性。 综合所述,原核表达是目前掌握最为成熟的表达系统,是目前运用大肠杆菌进行的抗菌肽基因工程研究的主要方式;其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需成本相对较低;但与此同时,原核表达系统还存在许多缺点,如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应。 另外,目的蛋白通常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难。而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域。 2.2　酵母菌表达体系 酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制及对表达产物的加工修饰和分泌能力,并且不会产生内毒素,是基因工程中良好的真核基因受体菌。 近年来应用最为广泛的是毕赤酵母。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母,能利用甲醇作为唯一碳源;它拥有一个很强的可被诱导的甲醇利用途径,乙醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径的第一个酶,甲醇是这个酶的诱导剂,而葡萄糖、乙醇、甘油等则是抑制剂。 Hong等(2007)运用毕赤酵母表达系统表达了人皮肤抗菌肽LL-37,该基因装载于pGAPZ-E/LL-37载体,转染毕赤酵母X-33,甲醇诱导表达。结果目的蛋白以分泌物的形式表达,产物纯化后经藤黄微球菌测试具有抗菌活性;该研究结果表明,抗菌