研究生实验课-2016植物生理.ppt

二、实验原理 因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。 核黄素 被氧化物质 还原的核黄素 氧 氮蓝四唑 蓝色的化合物 （560nm） 2 + 2H+ H2O2 + O2 SOD 植物组织中超氧物歧化酶活性的测定 实验步骤 试 剂（酶） 用量(ml) 终浓度（比色时） 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶液 蒸馏水 3 0.6 0.6 0.6 0.6 0.2 0.4 13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 对照管加缓冲液代替酶液 总体积 6.0 1、酶液提取 2、显色反应 表1 各溶液加入量 0.5g，加1ml磷酸缓冲液(pH7.8) 研磨成浆，加缓冲液使终体积为4ml。取2~3ml于10000rpm下离心10分钟 3、SOD活性测定 以不照光的对照管作空白，在560nm下分别测定其它各管的光密度值，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性。 SOD总活性 = 单位：酶单位/g鲜重表示； Ack―照光对照管的光密度值； AE—样品管的光密度值； V—样液总体积（ml）； a—测定时样品用量（ml）； W—样重（g）； 思考题 1、在SOD测定中为什么设暗中和照光两个对照管？ 2、影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？ 实验原理： 硫代巴比妥酸 TBA 丙二醛 3,5,5′-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川） 逆境 膜脂的过氧化作用 丙二醛 酸性 粉红色 植物组织或器官中丙二醛含量的测定 实验步骤： 1 MDA的提取 称2g叶片，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为MDA提取液。 2 MDA的测定 取1ml MDA提取液，加3ml 27％三氯乙酸和 1ml 2%TBA。混和液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定OD值。 结果计算 以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。 分别计算衰老和对照组的值。 MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(μmol/g FW)＝ D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。 注意事项： 0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA—TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为0.5 nmol·L-1） 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。 植物组织中过氧化物酶活性测定 原理 在过氧化物酶 (peroxidase) 催化下 ,H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在 470nm 处有最大光吸收, 故可通过测 470nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 方法和步骤 1. 酶液的制备 取 2g 材料 , 切碎 , 加适量的磷酸缓冲液（pH5.5）研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中 , 于 3000g 离心 l0min, 上清液转入 10ml 容量瓶中。 2. 过氧化物酶活性测定 2.9ml0.05mol.L-l 磷酸缓冲液 ；1.0m12%H202；1.0ml0.05mol.L-l 愈创木酚和 0.1ml 酶液。用加热煮沸 5min 的酶液为对照 , 反应体系加入酶液后 , 立即于 37 ℃水浴中保温15min, 然后迅速转入冰浴中 , 并加入 2.0ml20% 三氯乙酸终止反应 , 然后 , 过滤 ， 适当稀释 ,470m 波长下测定吸光度。 计算 以每分钟内 A470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位 (u)。 过氧化物酶活性 =(△A470 ·