流式细胞仪分析技术应用.ppt

外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞 培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤 单细胞悬液 一、免疫检测样品制备 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月） 1 × Phosphate Buffer Saline or HBSS (Ca/Mg++ free) 1 mM EDTA 25 mM HEPES pH 7.0 1 % Fetal Bovine Serum (Heat-inactivated) Sorting Buffer 淋巴细胞： 1x HBSS(with Ca++/Mg++)含1% FBS HBSS配方中的阳离子可增加细胞的生存力。由于这些细胞并非易于聚集，即便配方中沒有EDTA也不会造成问题。 较黏着的细胞(sticky cells)： 提高EDTA 到 5mM 并使用透析过的FBS (against Ca++/Mg++ free PBS)。某些细胞在活化会比较黏著而EDTA可抑制此作用 贴壁型细胞株(Adherent cells)： 以Trypsin处理后去准备单细胞悬液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，便以5 ml 含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬液。离心后，用sorting buffer调整细胞浓度。如果需要的话，可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免細胞重新黏聚。 含有高比例死細胞的样本： Sorting buffer加5mM MgCl2以及25~50 μg/mL DNAase I (Sigma D-4513)或是Sorting buffer加0.83mM MgCl2以及20 U DNAase II (Sigma D-4138)。这些配方可減少因死细胞释放出來的DNA所造成的细胞黏聚现象。 尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素 PE-Cy5/APC PerCP-Cy5.5/APC 为弱表达的抗原选择较亮的荧光素 CD62L on CD8+T 防止耦联染料降解（光照/固定/升温等）造成的干扰 APC-Cy7/PE-Cy7 二、常用的荧光染料与标记染色 尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素 Minimize the potential for spectral overlap Spillover estimates available in the spectra viewer 2 FITC Texas red PE.PC.APC PEcy5 FL1 FL2 FL3 FL4 激光 细胞悬液 异硫氰酸荧光素 得州红 能量传递复合染料 藻胆蛋白类 （一）几种常见的荧光染料 名称 染料 激发波长 荧光颜色 溶解性 对PH敏感性 特点 异硫氰酸荧光素 FITC 488 绿 525 易 敏感 易溶于水，与抗体结合不影响特异性 得州红 Texas red 568 红 615 不易 不敏感 稳定，偶联后量子产额低 藻红蛋白 PE 488 橙 575 易 不敏感 具较多发光基团，消光系数和量子产额高 藻青蛋白 PC 488 别藻青蛋白 APC 633 红 670 能量传递复合染料 PEcy5 488 红 670 易 不敏感 减少交叉，成本高 常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。 能量传递复合染料 PE CY5 CY5 CY5 488nm 575nm 670nm 红色荧光 花青苷5 藻红蛋白 能量传递复合染料机制 多色分析时组合抗体的使用原则 在免疫表型分析中，常常把多种荧光素标记抗体同时组合在一起进行多色分析，但并非多种抗体均可以自由组合在一起使用。在多数荧光素标记抗体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和组合应用的结果进行比较，一旦这种组合显示出与单独应用时无差别的结果时，这种组合才可以应用于多色免疫表型分析。 在单独或组合应用时，应注意抗体的稀释度。如3种抗体单独使用时的最佳用量为20μl，而3种抗体组合应用时如果各加20μl，总体积会增至60μl，因此每种抗体的浓度被稀释成原来的1/3，不再是最佳用量。因此组合抗体应用浓度应比单独抗体使用浓度高。一种新的抗体组合设计后必须进行这种比对试验，这种组合一旦应用与临床，不可随便改换抗体组合或抗体的克隆。 一般情况下多色分析荧光素标记抗体组合最好采用同一种工艺制作的为佳。 血液系统单细胞分选标准化的建立 背景 干细胞的研究意