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第八章 基因工程 基因工程 ( genetic engineering)、基因克隆、DNA重组、 DNA克隆、分子克隆 克隆（clone） 无性繁殖 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。 基因克隆示意图 基因工程大事记 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程 胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体 自然界的基因转移和重组 基因重组(genetic recombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的 结合作用 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌） 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程 转导作用 transduction 病毒、噬菌体介导 溶菌途径；溶原菌途径 基因工程 工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 真核细胞转染 克隆基因的表达 工具酶 一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖 1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。 发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。 细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。 原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。 假设：限制性内切酶与修饰酶。 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：HindⅡ Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。 限制性核酸内切酶(restriction enzyme) 识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 命名： EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) 识别和切割位点 回文结构 4～6 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端 粘性末端与平头末端 修饰酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性 5′至3′的聚合活性 5′→ 3′方向 核酸 外切酶活性 5′→ 3′外切酶活性 3′→ 5′外切酶活性 pol Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 大片段 （Klenow片段）：聚合活性、 3′→ 5′外切活性 常用的工具酶 核酸外切酶活性 3′→5′外切酶活性 5′→3′外切酶活性 载体 vector DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表达 克隆载体、表达载体 原核载体：质粒(pBR322,pUC…） 噬菌体（λ，M13）等 真核载体：动物病毒载体pLXSN等 常用的克隆载体 质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 理想的质粒 拷贝数多; 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr