免疫检测技术.PPT

免疫检测是目前生物学检测方法中用途最广泛的一种方法。 具有高度精确、灵敏、特异的特点。 可用于免疫学的基础理论和应用研究，也可应用于生物学研究的各个领域。 1 、免疫疾病诊断 2 、动物植物生理活动研究（激素、维生素） 3 、物种及微生物鉴定 4 、动物、植物性状的免疫标记 5 、免疫增强药物和疫苗的研究 6 、发病机理研究 7 、分子生物学研究 第一节 抗原抗体反应原理 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种 结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后 可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。 试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可用已知抗原检测标本中有无相应抗体。 一、体外抗原抗体反应的特点 ①特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。 ②可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定， 但在一定条件下可解离。（低酸、高盐） ③比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的 反应现象。（网格理论） ④阶段性：特异性结合阶段和可见反应阶段。 二、影响抗原抗体反应的因素 ①温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应 速度，缩短反应时间，常用反应温度为37-45℃。 ②溶液的pH：pH过高或过低可改变抗原和抗体理化 性质，影响反应结果，因此溶液的pH应适宜 （pH 6-8）。 ③电解质：反应中必须有适宜的电解质（0.85%NaCl） 参与，否则不出现可见反应。 三、抗原抗体反应类型 第二节 常见免疫检测方法 一、免疫沉淀反应 絮状沉淀试验 操作步骤： （1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 （2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。 （3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 （4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前 多用以测定抗原抗体反应的最适比。 环状沉淀试验 操作步骤： （1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免产生气泡。（已知！） （2） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待测！ ） （3） 置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。 应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。 2. 凝胶扩散沉淀 凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。 最常用的方法为： ①单向琼脂扩散试验 ②双向琼脂扩散试验 单向琼脂扩散试验 原 理： 将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂 凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质， 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并 在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉 淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 双向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离 打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原 和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩 散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常 用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于 两种抗原材料的抗原相关性分析。 3.免疫电泳技术 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。 免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳、免疫印迹等 血清免疫电泳 将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳 分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入 抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示 病人血清与正常人血清存在的差异，即血清 蛋白组分的缺少或增加。 火箭免疫电泳 火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散 免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起 来的一项定量技术，实质上是加速度的 单向扩散。 二、凝集反应（Agglutination） 颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解 质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块 称为凝集反应。 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。