内蒙古大学基因的工程大实验开的题目报告材料-绿色荧光蛋白.docVIP

实用标准文案 PAGE 精彩文档 学号 内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室 本科基因工程大实验开题报告 论文题目：绿色荧光蛋白基因表达载体的构 建及在大肠杆菌中的表达 学生姓名： 年 级： 专 业： 生物技术 指导教师： 苏慧敏 2012年 学生姓名 民族 性别 出生年月 论文题目 绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 开题时间 2012 结题时间 2012年 8 项目来源 本科生基因工程大实验课 一、立论依据 “绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”项目的选题和研究的意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处： 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)最初是从多管水母(Aequorea victoria)中发现的一种蛋白质。当水母发光蛋白结合Ca2+后发出蓝色荧光,该蓝光进一步激发绿色荧光蛋白产生绿色荧光。绿色荧光蛋白激发后发出的荧光持续时间较长,且不需要任何其他辅助因子的作用。绿色荧光蛋白能在多种生物, 如细菌、粘菌、酵母、植物和哺乳动物中表达并产生荧光。绿色荧光蛋白的这一种属不依赖的特性使其成为能被广泛运用的荧光标记分子[1]。野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短。GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67位残基(Ser-Tyr-Gly)自发形成对羟基苯咪唑啉酮基团而可以荧光发色[4]。 在1994年发现绿色荧光蛋白后，国内外对绿色荧光蛋白的研究进一步发展，目前在基因表达中可以利用绿色荧光蛋白进行基因整合、细胞分选及转基因动物的研，根据其颜色的特殊性在细胞生物学中作为荧光标记用于细胞动态的研究，在活细胞中可以利用其进行蛋白的定位，在western blotting中可作为一种体外检测手段[2]。 在随着分子生物学理论与技术的发展,对绿色荧光蛋白的理论研究进一步深入,并且绿色荧光蛋白在分子生物学领域的应用进一步加强,绿色荧光蛋白工程,包括绿色荧光蛋白蛋白工程和绿色荧光蛋白基因工程的迅速发展,尤其绿色荧光蛋白 基因作为新型报告基因越来越受到关注,目前已经应用GFP作为选择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒[2]。 绿色荧光蛋白如要在各领域得到更加完整全面的应用, 至少还需要几个条件: 基础理论体系的成熟完善、新型优良突变体的诞生以及与各种现代生物技术的融合。与此同时, 随着基因工程技术和细胞工程技术的日益成熟, 我们有理由相信,绿色荧光蛋白一定会给我们带来更多的应用价值, 并进一步揭开生命的未解之谜[3]。 大肠杆菌（Escherichia coli）遗传背景清楚，培养方便，转化效率高，繁殖快,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。大肠杆菌中存在的Lac启动子受分解代谢系统活化蛋白和cAMP的正调控和阻遏物的负调控，当加入IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变，阻遏蛋白不再能与操纵基因结合，从而使结构基因表达，便于进行筛选。 本实验研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-trx-EGFP-N3，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、电泳及IPTG诱导检测是否成功诱导表达。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 [1]张峰，任燕，陆长德《绿色荧光蛋白及其应用》1994.4生命科学第11卷第2期 [2]王晓丽，邵卫星，单虎《绿色荧光蛋白研究进展》动物医学进展，2008.29（1）：58 [3]吴沛桥，巴晓革，胡海。赵静《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》 生物医学工程研究 2009,28（1）：86 [4]Cody CW，Douglas CP，WiUiam MW et al，Biochemistry,1993,32(5):1212-1218． 二、实验方案 实验内容和实验目标，拟解决的关键问题： 1.1实验内容： 1.1.1载体pGEX-4T-1质粒DNA的小量制备 从超低温冰箱中取出保存pGEX-4T-1载体的菌种和pEGFP-N3的菌种，超净台中接种后37℃恒温摇床扩增；之后取少量菌液离心留沉淀备用，依次加入相应试剂提取质粒，进行凝胶电泳鉴定，之后在pGEX-4T-1质粒中加入适量RNaes A。 1.1.2质粒DNA电泳鉴定 制备电泳缓冲液，将适量的胶倒入凝胶灌制模具，待胶完全凝固，点入样品，将电泳仪调到适当的电